紫草素逆转人肺腺癌顺铂耐药的实验研究

周 娟，钟询龙，黄素超，郑宏明，卢琳琳

(1.广州医科大学附属第二医院药学部，广州 510260；2.广州中医药大学国际中医药转化医学研究所，广州 510006)

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，以顺铂(DDP)为代表的铂类联合其他化疗药是临床治疗肺癌的一线方案[1]，多数患者在化疗初期对药物敏感，表现为肿瘤体积缩小，临床症状明显减轻，但后期效果不佳，肿瘤细胞的多药耐药性是导致肺癌化疗失败的主要原因之一[2]。因此，临床迫切需要能逆转肿瘤细胞耐药的药物。

紫草为紫草科植物新疆紫草或内蒙紫草的干燥根，是我国常用中药材，味甘、咸，性寒，归心、肝经，具有清热凉血，活血解毒，透疹消斑等功效[3]。紫草素(Shikonin，SHK) 是一种萘醌类化合物，为紫草的主要有效成分之一，紫草素具有抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、抗炎、加速伤口愈合和增强免疫等功效[4]。目前，紫草素的抗肿瘤作用是研究的热点，紫草素可以通过抑制肿瘤细胞增殖，改变细胞周期，并诱导细胞凋亡等途径对多种肿瘤细胞产生作用[5]。研究表明紫草素可以显著抑制肺腺癌A549细胞增殖，诱导细胞凋亡[6-7]，但紫草素对肺癌顺铂耐药的影响报道相对较少，本研究通过体内体外两方面考察紫草素对人肺腺癌顺铂耐药的作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞株与实验动物

A549细胞、A549/DDP来源于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。SPF级BALB/c-nude雌性小鼠(46周，16～20 g)，购买于中山大学动物实验中心[许可证号：SCXK(粤)2016-0029]，饲养于广州中医药大学国际中医药转化医学院研究所SPF级实验动物中心[许可证号：SYXK (GZ) 2014-0144]。

1.2 仪器与试剂

紫草素购自成都曼思特生物科技有限公司，纯度大于或等于98%；顺铂购自山东齐鲁制药；环磷酰胺、MTT、玉米油购自Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1细胞培养 A549、A549/DDP细胞用含10%FBS和1%双抗的RPMI-1640完全培养基培养，置于5%CO2、37 ℃饱和湿度恒温培养箱中常规培养，隔天更换培养基。

1.3.2MTT法检测紫草素对A549、A549/DDP细胞毒性影响

1.3.2.1细胞准备 取生长状态良好的细胞胰酶消化、离心、加培养基混匀，按每孔2 000个细胞，把细胞接种到96孔板中，置培养箱中培养过夜，待细胞生长状态恢复后，再进行实验。

1.3.2.2设计药物浓度 紫草素按0、1、2、4、6 μmol/L设定给药浓度。

1.3.2.3给药处理 移除原有培养基，按实验设定药物浓度，每孔加入200 μL含药完全培养基，置培养箱中继续培养72 h。

1.3.2.4细胞毒性检测 给药结束后弃除培养基，加入用PBS配制的MTT溶液(0.5 mg/mL)，每孔100 μL，37 ℃恒温避光孵育4 h；接着弃去MTT溶液，加入DMSO(每孔150 μL)，置微孔板振荡器上快速振荡10 min、混匀，随后把96孔板置于多功能酶标仪中检测其吸光度OD值(测定波长为490 nm)。

1.3.2.5检测得到的OD值，使用软件GraphPad Prism5 制作生长抑制曲线，并计算药物半数抑制浓度IC50值。

1.3.3裸鼠异种移植瘤模型的建立

1.3.3.1动物处理及饲养 BALB/c-nude小鼠购回后，先在饲养的SPF级动物实验中心适应环境1周后，开始移植瘤模型的构建。

1.3.3.2肿瘤细胞的移植 将处于对数生长期，且生长状态良好的A549/DDP细胞消化后，用无血清的1640培养基混悬，并用台盼蓝染色后计算活细胞数，混悬细胞，按3.0×106/只将混悬好的细胞注射到裸鼠的右前肢腋下。

1.3.3.3接瘤后观察指标 肿瘤细胞移植后，每天观察肿瘤细胞在体内的生长的情况，并用游标卡尺测量肿瘤大小[肿瘤体积的计算公式：TV (mm3)=(L×W2)/2]，同时记录下裸鼠的体质量，并观察其精神状态、活动、饮食和大小便情况等。

1.3.4紫草素对A549/DDP裸鼠异种移植瘤的影响

1.3.4.1实验分组与给药 待肿瘤体积均达到50～100 mm3时，将裸鼠按照肿瘤体积和体质量分为5组：玉米油空白对照组(control)、环磷酰胺25 mg/kg阳性对照组(CTX)，顺铂2 mg/kg组(DDP)、紫草素2 mg/kg组(SHK)、顺铂2 mg/kg+紫草素2 mg/kg混合组(DDP+SHK)，每组8只。根据前期紫草素在体内抗肺腺癌药效实验结果[8]，给药方案予每天1次，按上述剂量连续23 d腹腔注射相应药物。

1.3.4.2给药期间检测指标 观察肿瘤细胞在体内的生长情况，并同时使用游标卡尺测量肿瘤大小，记录下裸鼠的体质量和肿瘤体积大小(3天/次)，并观察其精神状态、活动、饮食和大小便的情况。

1.3.4.3评价指标 结束23 d的给药后，解剖小鼠，分离取出肿瘤组织及心、肝、脾、肺、肾等主要器官，并分别进行称重、样品保存。

1.3.5A549对顺铂及紫草素的耐药指数评价

1.3.5.1细胞准备 A549细胞接种于75 flask，培养过夜，待细胞生长状态恢复，再进行后续实验。

1.3.5.2药物处理 移除原有培养基，分别加入含顺铂 (5 μmol/L) 或紫草素 (2 μmol/L)完整培养基各10 mL，置培养箱中继续培养。

1.3.5.3耐药培养 待细胞长至75 flask约80%时，胰酶消化，使用正常完全培养基按1∶3传代。重复上述步骤，使A549分别反复长期暴露于含顺铂 (5 μmol/L) 或紫草素 (2 μmol/L)的完全培养基，以获得A549顺铂耐药株或A549紫草素耐药株。

1.3.5.4耐药性评价 分别于长期药物暴露的第0、5、16、20代，使用MTT法，检测顺铂(0、2、4、6、8、10、20 μmol/L)和紫草素(0、1、2、4、6、8 μmol/L)对细胞株活力影响。使用软件Graph Pad Prism5计算药物半数抑制浓度IC50值。利用耐药指数评价细胞耐药性：耐药指数(RI)= IC50(第X代)/IC50(第0代)。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1紫草素对人肺腺癌A549/DDP耐药性的逆转作用

紫草素分别干预A549细胞、A549/DDP耐药细胞，MTT法检测A549细胞IC50值为2.27 μmol/L，A549/DDP耐药细胞株的IC50为0.95 μmol/L，实验结果表明，A549顺铂耐药株对紫草素不具有耐受性，相反，紫草素对A549顺铂耐药细胞具有更高的杀伤效力，见图1。

图1 MTT法检测紫草素对A549细胞、A549/DDP耐药细胞的细胞活力

2.2 紫草素对A549/DDP裸鼠异种移植瘤的抑制作用

建立A549/DDP顺铂耐药移植瘤裸鼠模型，按“1.3.4”项下方法分5组考察紫草素 (SHK,2 mg/kg) 对耐顺铂A549细胞的体内生长抑制率。与对照组相比，给药期间小鼠的体质量无明显变化，且各组差异不大 (图2A)。与对照组相比，DDP、SHK、DDP+SHK以及25 mg/kg CTX组均可以抑制肿瘤的生长，肿瘤体积及重量如图2B、图2C)，其中，紫草素可有效阻滞A549/DDP耐药细胞的体内生长 (抑瘤率35.91%，P<0.05)，且与顺铂联合给药时，更能显著增加A549/DDP细胞对顺铂的敏感性(联合组抑瘤率46.19%vs.顺铂给药组抑瘤率13.98%，P<0.01)。解剖各组小鼠取常规脏器心、肝、脾、肺、肾，检测脏器指数，结果显示各组脏器指数无明显差异(图3)。

2.3 紫草素耐药指数评价

在上述试验中，笔者发现紫草素对于A549/DDP 的敏感性较单纯的A549更高，在体内可抑制耐药细胞生长，且在体内与顺铂联合给药时，更能显著增加A549/DDP细胞对顺铂的敏感性。但长期使用紫草素是否会产生类顺铂样耐药性尚未清楚，本研究以顺铂为阳性对照，采用逐代耐药筛选实验，MTT法检测，结果显示经顺铂(5 μmol/L)处理的A549敏感期IC50值为9.08 μmol/L，培养至第20代，IC50值为30.38 μmol/L，计算耐药指数RI为3.35(表1)，且细胞存活率呈逐代上升趋势(图4A)，说明A549细胞对顺铂逐渐产生耐药性。相反，经紫草素(2 μmol/L)干预的A549细胞耐药指数呈现下降的趋势(表1)，细胞存活率呈逐代下降趋势(图4B)表明紫草素无类顺铂样耐药反应。

A：A549/DDP耐药移植瘤裸鼠在给药期间体质量(n=8);B：药物干预后各组肿瘤组织体积比较;C：肿瘤组织照片及其重量;*:P<0.05,**:P< 0.01;***:P<0.001，与对照组比较,△:P<0.05,△△:P<0.01，与顺铂组比较

图2紫草素对A549/DDP裸鼠异种移植瘤的抑制作用

A：心；B：肝；C：脾；D：肺；E：肾

图3药物干预后各组移植瘤裸鼠脏器指数评估

表1 顺铂及紫草素对A549肺腺癌细胞耐药指数评价

A：顺铂5 μmol/L ；B：紫草素2 μmol/L干预下A549细胞的存活率

图4 MTT法检测长期顺铂和紫草素

3 讨 论

在威胁人类生命健康的各种恶性肿瘤中，肺癌的发病率和死亡率一直居高不下，其主要的原因在于其易发性、耐药性和高转移性[8]。肺癌细胞对化疗药物产生耐药是影响疗效和预后的重要因素[2]，因此，铂类耐药是临床治疗肺癌的难题，期望能找到有效的抑制剂，与铂类药物联合使用提高疗效。紫草素对多种肿瘤细胞具有杀伤作用且可增加抗肿瘤治疗敏感性[9]。关于紫草素对肺腺癌化疗逆转耐药性的研究鲜有报道，本文通过体内、体外相结合实验证实，紫草素在不产生细胞毒性条件下能够逆转人肺腺癌耐药细胞A549/DPP 对顺铂的耐药性，紫草素与顺铂联合用药后，增强顺铂对肺腺癌耐药细胞株的杀伤作用，提高耐药细胞株对顺铂的敏感性。

综上所述，紫草素具有逆转肺腺癌顺铂耐药作用，而且具有目前临床药物所缺乏的高效、安全性较好的优势，有很大的研究价值。