花生红衣水提物对小鼠的镇静催眠作用*
2018-12-28丽文
丽文
(济宁医学院基础医学院,济宁 272067)
随着社会经济的飞速发展,生活节奏的日益加快,失眠的发病率逐年攀升,严重危害人类的身心健康,失眠已成为严重的社会和医学问题。目前临床上治疗失眠的药物主要是苯二氮卓类镇静催眠药,但长期服用这些药物不仅会产生头昏、乏力等副作用,而且可产生明显的耐受性、依赖性和“日间宿醉反应”。纯植物提取物在改善睡眠方面有着独特优势,具有毒副作用小,无成瘾性等特点,是目前研究镇静催眠药物的新方向。花生茎叶提取物有镇静催眠作用[1-2],花生叶水煎液(落花安神合剂)已应用于临床且疗效显著[3]。花生红衣(花生的种皮)具有抗氧化、抗过敏、降血糖、降血脂、止血等药理作用[4],但目前国内外对其镇静催眠作用研究尚未见报道。本文通过对小鼠自主活动、协同戊巴比妥钠催眠作用以及小鼠脑组织中GABA含量变化的研究,初步探讨花生红衣水提物的镇静催眠作用及作用机制,为进一步开发利用花生红衣提供基础实验依据和理论支持。
1 材料
1.1 动物
昆明种小鼠,雄性,体重(20±2.0)g,由济宁医学院实验动物中心提供。动物管理均遵循国家实验动物饲养管理条件和使用指南以及济宁医学院实验动物管理条件。
1.2 药物与试剂
花生红衣,购于济宁广联药店中药房;地西泮注射液(湖北制药厂,批号:971101);戊巴比妥钠(中国医药集团上海化学试剂公司,批号:F20021216);GABA试剂盒(厦门慧嘉生物科技有限公司,批号:201505221922)。
1.3 仪器
HH-SJ数显恒温磁力搅拌油浴锅(金坛市友联仪器研究所);电子天平(北京赛多利仪器系统有限公司);ACS-30型电子计价秤(武义县金宇衡器有限公司);ZZ-6小鼠自主活动测试仪(成都泰盟科技有限公司);Thermo MK3酶标仪(上海赛默科技生物发展有限公司)。
2 方法
2.1 花生红衣水提物的制备[5]
取花生红衣生500g,加入12倍量的蒸馏水,100℃回流 2 次,每次2h,过滤,合并两次滤液,用蒸发皿蒸发浓缩成干浸膏,加生理盐水配成浓度为1250、625、312.5mg/kg 的花生红衣水提物备用。
2.2 花生红衣水提物对小鼠自主活动的影响
取50只小鼠,适应性喂养一周后,随机分成5组:空白对照组、地西泮阳性对照组(2mg/kg)、花生红衣水提物高、中、低剂量组(1250mg/kg、625 mg/kg、312.5mg/kg),每组10只。花生红衣各剂量组每只小鼠每日灌胃给予相应剂量的药物,给药容积为0.2ml/10g,空白对照组给予等体积生理盐水,1次/d,连续给药7d。地西泮阳性对照组灌胃等体积生理盐水,连续6d,第7天时一次性灌胃给予2mg/kg地西泮,给药容积为0.2ml/10g。
小鼠末次给药30min后,将各组小鼠放置于自主活动记录仪中,先适应10min,再开始记录,记录各组小鼠5min内的自主活动次数。
2.3 戊巴比妥钠阈下和阈上睡眠剂量测定
2.3.1阈下剂量[6]取50只小鼠,随机分为5组,每组10只。各给药组分别腹腔注射戊巴比妥钠27、28、29、30mg/kg,空白对照组注射相同容量的生理盐水。记录15min内翻正反射消失超过1min的小鼠数量,并使之作为入睡指标。
2.3.2阈上剂量[6]取小鼠50只,随机分为5组,每组10只。各给药组分别腹腔注射戊巴比妥钠32、35、40、45 mg/kg,空白对照组注射等容量的生理盐水。记录15min内翻正反射消失超过1min的小鼠数量,并使之作为入睡指标。
2.3.3判断指标[7]翻正反射消失:小鼠四肢朝上仰卧1min内没有翻转过来,说明已进入翻正反射消失阶段。
翻正反射恢复:小鼠可以自由翻转并且1min内不再翻转不过去,说明翻正反射恢复。
入睡潜伏期:从注射药物开始到翻正反射消失之间所用的时间。
睡眠时间:从翻正反射消失到翻正反射恢复所用的时间。
2.4 花生红衣水提物对阈下剂量戊巴比妥钠小鼠入睡率的影响
动物分组、灌胃给药方法同“2.2”,各组小鼠按照相应的药物连续灌胃7d。并在末次给药后30min,给各组小鼠腹腔注射戊巴比妥钠阈下剂量29 mg/kg,给药体积为0.1ml/10g。观察并记录给药后15min内各组小鼠的入睡情况并记录各组小鼠的入睡只数,以翻正反射消失>1min为入睡判断标准,计算各组小鼠睡眠发生百分率(入睡率)。
入睡率(% )=入睡动物数/动物总数×100%
2.5 花生红衣水提物对阈上剂量戊巴比妥钠小鼠入睡潜伏期和睡眠时间的影响
动物分组、灌胃给药方法同“2.2”,各组小鼠按照相应的药物连续灌胃7d。于末次给药30min后,给各组小鼠腹腔注射戊巴比妥钠阈上剂量40 mg/kg,给药体积为0.1 ml/10g。观察并记录各组小鼠的入睡潜伏期及睡眠持续时间。
2.6 小鼠脑组织内GABA含量测定
末次药后30 min,脱臼处死小鼠,取出大脑,冰冷生理盐水冲洗,滤纸吸干,称重,匀浆机匀浆,3000 r/min离心10 min,取上清液,按照试剂盒说明书,采用ELISA法测定GABA含量。
2.7 脏器系数[8]
实验结束后,各小组小鼠脱臼处死前称体重,解剖取出其心、肝、脾、肺、肾组织,除去上述器官周围脂肪结缔组织,用滤纸吸干脏器表面血液后称重,并计算脏器系数:脏器湿重(mg)/体重(g)
2.8 统计学方法
3 结果
3.1 花生红衣水提物对小鼠自主活动的影响
与空白对照组比较,地西泮阳性对照组和花生红衣低剂量组均可显著减少小鼠5min内的自主活动次数和站立次数(P<0.05),表明花生红衣水提物具有抑制小鼠的自主活动的作用。红衣水提物3剂量组之间不存在量效关系。见表1。
表1 花生红衣水提物对小鼠自主活动的影响
注:与空白对照组比较,*P<0.05;与地西泮阳性对照组比较,#P>0.05。
3.2 戊巴比妥钠阈下、阈上睡眠剂量
戊巴比妥钠27 mg/kg、28 mg/kg小鼠入睡率为0%;29 mg/kg小鼠入睡率为10%;30、32、35 mg/kg小鼠入睡率分别为20%、30%、90%;40 mg/kg和45 mg/kg小鼠入睡率100%。因此,戊巴比妥钠阈下睡眠剂量确定为29 mg/kg,阈上睡眠剂量确定为40 mg/kg。见表2。
表2 不同浓度戊巴比妥钠对小鼠的镇静催眠作用
3.3 花生红衣水提物对阈下剂量戊巴比妥钠致小鼠催眠作用的影响
与空白对照组相比,地西泮阳性对照组和花生红衣水提物低剂量组小鼠入睡率明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05),而花生红衣水提物高、中剂量组小鼠入睡率无显著增加。提示花生红衣低剂量组与戊巴比妥钠阈下剂量具有协同作用,可提高小鼠入睡率。红衣水提物3剂量组之间不存在量效关系。见表3。
表3 阈下剂量小鼠入睡只数及入睡率
注:与空白对照组比较,*P<0.05;与地西泮阳性对照组比较,#P>0.05。
3.4 花生红衣水提物对阈上剂量戊巴比妥钠致小鼠催眠作用的影响
与空白对照组相比,花生红衣水提物高、中剂量组虽可缩短小鼠睡眠潜伏期并且延长小鼠睡眠持续时间,但差异并无统计学意义(P>0.05);花生红衣水提物低剂量组和地西泮阳性对照组均可缩短小鼠入睡潜伏期并且延长小鼠睡眠持续时间,差异显著(P<0.05)。红衣水提物3剂量组之间不存在量效关系。见表4。
表4 阈上剂量小鼠入睡潜伏期及睡眠时间
注:与空白对照组比较,*P<0.05;与地西泮阳性对照组比较,#P>0.05;与空白对照组比较,**P>0.05。
3.5 花生红衣水提物对小鼠脑内GABA含量影响
与空白对照组相比,花生红衣水提物高剂量组虽可升高小鼠脑内GABA含量,但差异无统计学意义(P>0.05);但地西泮阳性对照组、花生红衣水提物中、低剂量组小鼠脑内GABA含量明显升高,差异显著(P<0.05)。花生红衣水提物各剂量组之间无量效关系。见表5。
表5 各组小鼠脑组织GABA含量比较
注:与空白对照组比较 ,*P<0.05;与地西泮阳性对照组比较,#P>0.05;与空白对照比较,**P>0.05。
3.6 花生红衣水提物对小鼠脏器的影响
花生红衣水提物高剂量组脾脏系数与空白对照组相比有统计学意义(P<0.05),说明花生红衣水提物高剂量组对小鼠的脾脏可能有损伤作用。见表6。
表6 各组小鼠脏器系数
注:与空白对照组比较 ,*P<0.05;与地西泮阳性对照组比较,#P>0.05。
4 讨论
花生茎叶已用于临床治疗失眠,但同属落花生种属的花生红衣是否具有镇静安神作用,国内外尚无相关研究报道。本文旨在初步探索花生红衣的镇静催眠作用及可能的作用机制,为继续寻找开发具有镇静催眠作用的纯天然植物药物奠定基础。
自发活动实验是评价中枢神经系统兴奋状态的常用方法[9],动物的自发活动情况反映出中枢神经系统的功能状态,中枢神经系统兴奋时动物活动次数增加,中枢神经系统抑制时,动物的自主活动减少。本文结果表明,与空白对照组相比,花生红衣水提物低剂量组和地西泮阳性对照组小鼠的自发活动次数和站立次数均明显减少(P<0.05),且花生红衣水提物低剂量组和阳性对照组相比差异无统计学意义(P>0.05),说明低剂量花生红衣水提物能显著减少小鼠自主活动次数,降低大脑皮层兴奋性,具有一定的镇静作用。
戊巴比妥钠协同催眠实验是研究镇静催眠药物催眠作用的常用实验之一[10]。戊巴比妥钠是典型的中枢抑制药,戊巴比妥钠主要通过肝药酶进行代谢,因此对肝药酶有抑制作用的药物也能延长戊巴比妥钠所致实验动物的睡眠时间,为排除此影响,采用了戊巴比妥钠阈下剂量进行实验[11],同时还通过阈上剂量戊巴比妥钠实验,观察花生红衣水提物对小鼠失眠情况的影响。本文结果表明,与空白对照组比较,花生红衣水提物低剂量组和阈下剂量戊巴比妥钠合用,可显著增加小鼠入睡率;花生红衣水提物低剂量组和阈上剂量戊巴比妥钠合用,可明显缩短小鼠入睡潜伏期及延长小鼠的睡眠持续时间,而且花生红衣低剂量组和地西泮阳性对照组相比差异无统计学意义(P>0.05),表明花生红衣水提物具有协同戊巴比妥钠催眠作用。
GABA 为中枢神经系统内最重要的抑制性神经递质,可通过与 GABA受体(GABAA)结合,导致大量CL-内流,引起细胞膜超极化使神经元兴奋性降低,发挥镇静催眠作用[12]。本研究发现,与空白对照组相比,花生红衣低剂量组可明显提高小鼠脑组织中 GABA 含量,而且花生红衣低剂量组和地西泮阳性对照组相比差异无统计学意义(P>0.05),提示花生红衣水提物可能通过提高小鼠脑内GABA水平发挥镇静催眠作用。
心、肝、脾、肺、肾这些器官的重量变化,可以反映出动物体内某些器官功能的变化。本文结果表明,与空白对照组相比,花生红衣水提物高剂量组的脾脏系数明显减少(P<0.05),表明花生红衣水提物高剂量组可能对小鼠的脾脏有损害作用,花生红衣中、低剂量组对小鼠的各个器官均无损伤作用。
通过本研究,结果显示花生红衣水提物低剂量组镇静催眠效果较好且对动物脏器无损伤。并初步推测花生红衣水提物升高小鼠脑内GABA水平可能是其分子机制之一,但是否与脑内其他神经递质有关尚需进一步探索、研究,另外其镇静催眠的具体有效成分还不明确,也有待我们研究、确定。
我国花生产量世界第一,其用于榨油的副产品花生红衣却一直大量被弃置,若能将其开发利用为治疗失眠的食品或药品,必将具有良好的发展前景。