UNC-51样激酶1在食管癌组织中的表达及其意义

刘欣韵， 蒋小芹， 鲍晶晶， 窦蓉蓉， 刘福兴， 戴桂红，朱晓蔚， 陈民， 于鸿

(泰州市人民医院 1. 病理科， 2. 皮肤科， 江苏 泰州 225300)

细胞自噬是一种广泛存在于真核生物中的正常生理过程，一旦机体出现自噬过度或自噬不足都可以导致疾病的发生，自噬活性的改变与肿瘤的发生、发展密切相关[1]。真核生物中至少存在36种自噬相关基因[2]，其中哺乳动物中的同系物有两种：UNC-51样激酶1(UNC51-like kinase 1,ULK1)和ULK2[3]。其中ULK1在细胞自噬过程中起着中心角色的作用[4]。近来研究显示，ULK1表达与乳腺癌、肝细胞癌和食管癌等肿瘤预后密切相关[5]。本研究应用组织芯片技术对94例食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)及78例癌旁组织进行了分析, 以进一步验证ULK1作为ESCC生物标志物的可能性。

1 材料与方法

1.1 对象和组织样本

94例食管癌标本均来自本院2011年1月至2016年1月间手术病例，其中，男70例，女24例；年龄41～81岁(中值65岁)。所有样本均经病理检查诊断为鳞状细胞癌。病理分级：Ⅰ级31例，Ⅱ级51例，Ⅲ级12例；TNM分期：Ⅰ期5例，Ⅱ期50例，Ⅲ期37例，Ⅳ期2例。34例有淋巴结转移(36.2%)，肿瘤大小1.2～10 cm(中值4.5 cm)。所有患者在肿瘤切除前均未接受任何抗癌治疗。本项目经泰州人民医院伦理委员会批准，患者均签署了知情同意书。

1.2 组织芯片制备

食管癌组织芯片由上海芯超生物科技有限公司制备，具体制作方法参照文献[6]。首先对每一个供体蜡块进行切片和HE染色，显微镜下对所需穿取的目标组织定位，选取癌组织、癌旁组织共计172个位点(癌组织94个、癌旁组织78个)。利用组织芯片制作仪(Beecher Instruments公司)，依次从供体蜡块上穿取直径为1.5 mm的组织芯，插入有172点阵的受体蜡块中，以4 μm的厚度连续切片。所得组织芯片的每个点都经过病理诊断。

1.3 免疫组织化学染色

63 ℃烤片1 h，常规脱蜡水化；使用EDTA热修复法修复抗原20 min，水池中冷却30 min；取出置于内源性过氧化物酶阻断剂中15 min； PBS缓冲液冲洗3次；滴加兔抗人多克隆抗体(1 ∶30，DAKO公司)；冰箱4 ℃过夜；PBS缓冲液冲洗3次；滴加EnVisionTM+/HRP兔工作液(丹麦DAKO公司)，孵育30 min； PBS冲洗3次；DAB显色，蒸馏水水洗终止显色；苏木素复染、水洗、分化后充分水洗返蓝；常规脱水、透明，中性树胶封片；PBS代替一抗作为阴性对照，同时每张切片设置自身对照。

1.4 结果判定

1.4.1 组织芯片染色结果判定 将组织芯片中研究样本充足、易于观察的位点判断为有效患者；而切片折叠、着色失败以及观察时未能找到癌细胞的位点，判断为无效或无意义患者。在研究样本中剔除无效或无意义患者。

1.4.2 免疫组织化学结果判定 染色强度结果： 无着色为0分，着色较弱为1分，着色适中为2分，着色较强为3分。ULK1阳性细胞的百分比分值：无阳性细胞为0分，小于20%为1分，20%～75%为2分，>75%为3分。染色强度和阳性细胞百分比积分两者乘积得分>4时为高表达，≤4时为低表达。

1.5 统计学处理

采用SPSS 20.0软件进行统计分析。各组间显著性检验采用四格表χ2检验。使用Kaplan-Meier法和Log-rank检验分析ULK1表达程度对食管癌患者生存期的影响。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ULK1在ESCC和癌旁组织中的表达

成功构建172个位点的组织芯片(含94个癌组织位点及78个癌旁组织位点，图1)。免疫组化结果显示，ULK1在食管癌组织及癌旁组织中均有不同程度的表达(图2)。ULK1蛋白主要定位在细胞胞质，少部分在细胞核中也有表达。在癌旁组织中，有40例不表达ULK1蛋白。根据上述结果判定标准，将表达ULK1的组织位点分为高表达组与低表达组。对食管癌组织和癌旁组织ULK1的表达进行χ2检验，结果显示ULK1在食管癌组织胞质和细胞核中的表达均明显高于癌旁组织(均P<0.01)。见表1。

图1 含172个位点的食管癌及癌旁组织芯片

2.2 ULK1表达水平与ESCC患者病理特征的关系

ULK1表达高低与淋巴结转移具有显著相关性(P<0.05)。年龄、肿瘤大小、病理分级以及TNM分期等临床病理特征与ULK1表达高低无明显关系。见表2。

图2 食管鳞状细胞癌中ULK1的表达

分组细胞质细胞核癌组织癌旁组织癌组织癌旁组织高表达组442141低表达组26211014χ2值20.31610.411P值<0.01<0.01

表2 ULK1的表达与患者临床病理特征的关系

2.3 生存分析

ESCC患者的随访时间为0～61个月。94例ESCC患者的中位生存时间(median survival time，MST)为30个月。ULK1胞质高表达者MST为33个月，而ULK1胞质低表达者的MST为22个月(P=0.036，图3)。ULK1低表达患者的生存率明显低于ULK1胞质高表达者(危险比=1.754，95%CI1.022～3.010，P=0.041)。

图3 ULK1不同表达水平患者的生存曲线

3 讨论

哺乳动物细胞中的自噬过程分为3类形式：大自噬，小自噬，分子伴侣介导的自噬。其中大自噬作为一种强有力的降解机制，可将胞质中的蛋白分子甚至是整个细胞器降解消除，因此大自噬在肿瘤抑制和免疫方面发挥着最为重要的作用[7-8]。作为人类高保守自我保护机制，自噬通过选择性破坏肿瘤细胞抑制肿瘤的进一步发展，而作为一种控制大自噬发生的重要激酶，ULK1 在恶性肿瘤的发生发展中扮演着极为重要的角色。Tang等[9]报道ULK1表达水平与乳腺癌患者的生存期呈正相关，高表达者生存期长，并且ULK1表达水平是乳腺癌患者的一个独立预后因素。我们的前期研究却发现肝细胞癌中ULK1高表达患者预后不良[10]。Jiang等[11]的研究显示，相比于ULK1低表达ESCC患者，ULK1高表者预后较好。本研究结果也显示，ULK1高表达的ESCC患者生存期显著高于低表达者，与Jiang等研究结果基本一致。上述研究结果表明，ULK1在不同肿瘤细胞中可能具有不同的作用机制。随着对自噬过程研究的深入，人们已经意识到自噬在肿瘤的发生发展过程中扮演着“双刃剑”的角色，在不同的肿瘤类型、阶段、微环境中，自噬既可促进肿瘤的发生发展，也可起抑制作用[12-13]。本研究结果显示，ULK1在食管癌组织中的胞质和细胞核中的表达均显著高于癌旁组织，ULK1的表达高低与淋巴结转移及患者生存期显著相关，提示ULK1在ESCC的发生、发展过程中起着重要作用。大量研究已经证实，肿瘤细胞的生长依赖血管的形成， 而ESCC是一种缺乏充足血供的实体肿瘤，但ESCC细胞的快速增殖又需要足够的营养及氧气，这就意味着ESCC细胞经常需要承受严重缺氧及代谢压力，而自噬的活跃可以为癌细胞提供能量，降解细胞内毒性成分，维持癌细胞的代谢平衡，从而阻止癌细胞的凋亡及坏死发生[14]。因此，ULK1在食管癌组织中的表达显著高于癌旁组织可能与上述机制有关。但本研究结果还显示，与无淋巴结转移患者相比，ESCC发生淋巴结转移时的ULK1表达反而是降低的，即ULK1低表达的ESCC患者生存期显著低于高表达者，我们推测可能与在ESCC不同分期阶段，自噬发挥着不同作用有关，但具体机制有待进一步的深入研究。

发现和验证各种新的用于肿瘤早期诊断、预后和个性化治疗的分子生物标志物，已成为近年来肿瘤领域的研究热点。本研究结果显示ULK1在ESCC癌组织中的表达明显高于癌旁组织，ULK1表达水平与患者淋巴转移情况和生存期相关，并且ULK1高表达的ESCC患者拥有更长的生存期，提示ULK1可能是ESCC潜在的分子标志物。但正如前述，自噬在肿瘤的发展过程中具有两种相反的作用，ULK1的高表达并不一定意味着肿瘤的进行性恶性发展，ULK1在ESCC发生发展中的确切机制仍有待于进一步的研究。