四君子汤血清药效成分的HPLC-MS分析

尚如霞， 徐卫东， 许晓倩， 彭云

(1. 镇江市食品药品监督检验中心， 江苏 镇江 212002； 2. 江苏大学药学院， 江苏 镇江 212013)

四君子汤组方为人参、白术、茯苓、甘草，其中，人参为君药，有抗疲劳、增强免疫力的功效；白术为臣药，有健脾燥湿利尿功效；茯苓为佐药，有抗肿瘤、渗湿健脾功效；甘草为使药，甘缓和中，有抗病毒功效。四药相辅，温而不燥，补而不峻，共奏益气健脾之功。其作为传统的健脾基础方，在肝干细胞的再生和肝细胞保护等方面起重要作用[1]，对肝纤维化、酒精性肝病、脂肪肝、肝炎等都有很好的疗效。但是，其对肝干细胞的作用机制目前尚未阐述清楚，组方发挥药效的物质基础也不明确。基于此，本文采用高效液相色谱-质谱法(high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS)，通过分析四君子汤水煎液和含药血清中的化学成分，探讨其发挥药效的物质基础。

1 材料与方法

1.1 材料

雄性SD大鼠6只，体质量260～300 g，由江苏大学实验动物中心提供(动物合格证号：201723805)。药品均购买自镇江市老存仁堂药店：白参片，产地吉林，批号170908，靖江市白山参茸有限公司；茯苓，产地安徽，批号180101，亳州吉贝尔中药饮片有限公司；炙甘草，产地甘肃，批号171128，江苏华洪药业科技有限公司；白术，产地安徽，批号171201，安徽黄太中药饮片科技有限公司。乙腈(色谱纯，美国Tedia公司)。超低温冰箱(日本Sanyo公司)；超速离心机(江苏省金坛市医疗仪器厂)；液相色谱离子阱质谱联用仪配备电喷雾离子源(ESI，美国Thermo Fisher公司)。

1.2 四君子汤水煎液的制备

按四君子汤处方中药物的比例，取人参、白术、茯苓各9 g，炙甘草6 g，置于500 mL烧杯内，加10倍质量的水浸泡0.5 h；将烧杯放入加热套中，煮沸，再煎煮1 h；过滤，分离滤液和残渣；残渣加水6倍，煮沸后再煎煮1 h；过滤得滤液和残渣；再将残渣加水煮沸1 h，过滤得滤液；将3次滤液合并，置于烧杯；将烧杯置于加热套内浓缩药液至0.125 g/mL。放置4 ℃保存。

1.3 含药血清的制备

将6只大鼠分为实验组(n=4)和对照组(n=2)。实验组用浓缩好的四君子汤水煎液，按1 mL/100 g剂量(为临床成人剂量的10倍)灌胃，1次/d，连续7 d；对照组采用蒸馏水灌胃。在采血前禁食不禁水12 h以上，末次给药后2 h，用5%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，剂量为0.1 mL/100 g；麻醉后采用颈动脉插管于心脏取血(不抗凝)，静置30 min，3 000 r/min室温离心10 min；取上层血清，以0.22 μm微孔滤膜进行血清除菌，做好标记，-80 ℃储存备用。

1.4 样品处理

取含药血清约4 mL，加入20 mL甲醇快速混匀震荡，密闭超声提取15 min；3 500 r/min室温离心10 min；取上清液后放入坩埚里加热浓缩，蒸干后加入1 mL甲醇溶解，0.45 μm滤膜过滤，进样分析。

对照组血清用于质谱分析时作为空白对照，排除空白血清的干扰。

1.5 分析条件

1.5.1 色谱条件 Betasil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相A：高纯水，B:乙腈；流速：0.4 mL·min-1；进样量2 μL；柱温：35 ℃；样品室温：4 ℃；梯度洗脱条件如表1所示。

1.5.2 质谱条件 ESI；喷雾电压：3.5 kV；负离子检测；鞘气(N2)流速：80 arb；辅助气(N2)流速:5 arb；毛细管温度：300 ℃；毛细管电压：-30 V。采用全离子扫描方式，扫描范围(m/z)：100～1 200，碰撞气体：氦气；碰撞室能量：35 V；检测波长： 210、240、280 nm。

2 结果

2.1 四君子汤化学成分分析

根据HPLC-MS联用扫描得到的质谱图(图1、图2)，查阅参考文献[2-3]，推断出四君子汤水煎液中含10种化学物质，其中皂苷类7种，分别为人参皂苷Rb1、Re、Rg1、Rb2、Rd、Rg3、甘草酸；黄酮类3种，分别为甘草苷、甘草素、甘草香豆素；其中人参皂苷Rb1、Re、Rg1、甘草酸为四君子汤的指标性成分。因茯苓中的萜类和有机酸，白术中的内酯类均不溶于水，故四君子汤水煎液中未能检测到相关化合物。

推断出四君子汤的含药血清中含3种化学原型成分，分别为人参皂苷Rb1、Re、甘草酸；2种代谢产物分别为甘草次酸、甘草素葡萄糖醛酸。甘草次酸是由甘草酸水解脱去糖酸链所形成，甘草素葡萄糖醛酸亦为甘草酸水解后生成。见表2、3。

图1 四君子汤水煎液总离子流图

图2 含药血清的总离子流图

序号保留时间(min)MrMS2成分推测168.26368367,309,297甘草香豆素298.78418417,255,135甘草苷3102.11256255,135甘草素4105.47801800,637,475人参皂苷Rg15107.85947945,783,637,474,390人参皂苷Re6120.161 1091 107,945,783,620,459人参皂苷Rb17127.211 0791 077,946,783,621,458人参皂苷Rb28136.55947946,783,621,459,375人参皂苷Rd9158.39822821,803,645,351甘草酸10160.68785783,620,458人参皂苷Rg3

表3 含药血清化学成分分析数据

2.2 四君子汤血清原型化合物鉴定

在保留时间为87.69 min处，得到1 107.08 m/z的离子峰，查阅文献[4]，人参中存在的人参皂苷Rb1分子式为C54H92O23，Mr为1 109.29，推测1107.08 [M-H]-m/z为其准分子离子峰；对1 107.08 m/z行MS2分析，得到945.20，782.88，620.68，459.80 m/z等碎片峰；根据元素组成分析，推测该化合物为人参皂苷Rb1。见图3。

图3 含药血清中人参皂苷Rb1的二级质谱图

在保留时间为74.43 min处，得到945.51 m/z的离子峰，查阅文献[5]，人参中存在的人参皂苷Re分子式为C48H82O18，Mr为947.17，推测945.51 [M-H]-m/z为其准分子离子峰；对945.51 m/z行MS2分析，得到798.78，636.88，474.40 m/z等碎片峰；根据元素组成分析，推测该化合物为人参皂苷Re。见图4。

图4 含药血清中人参皂苷Re的二级质谱图

在保留时间为 126.34 min处，得到821.72 m/z的离子峰，查阅文献[6]，甘草中存在的甘草酸分子式为C42H62O16，分子量为822.93，推测821.72 [M-H]-m/z为其准分子离子峰，对 821.72 m/z行MS2分析，得到644.85，350.62 m/z等碎片峰；根据元素组成分析，推测该化合物为甘草酸。见图5。

图5 含药血清中甘草酸的二级质谱图

2.3 四君子汤血清代谢产物的鉴定

在保留时间为102.17 min处，得到469.50 m/z的离子峰，根据文献报道[7]，甘草代谢产物中含有甘草次酸，分子式为C30H46O4，Mr为470，推测469.50 m/z为其准分子离子峰；对469.50 m/z行MS2分析，得到 423.47 m/z等碎片峰；根据元素组成分析，推测该化合物为甘草次酸。见图6。甘草次酸是由甘草酸水解脱去糖酸链所形成。

在保留时间为61.53 min处，得到255.27 m/z的离子峰，根据文献报道[8]，甘草代谢物中存在甘草素葡萄糖醛酸，Mr为256，推测255.27 m/z为其准分子离子峰；对255.27 m/z行MS2分析，得到237.36、195.28、135.12 m/z等碎片峰；根据元素组成分析，推测该化合物物为甘草素葡萄糖醛酸。见图7。

图6 含药血清中甘草次酸的二级质谱图

图7 含药血清中甘草素葡萄糖醛酸的二级质谱图

3 讨论

根据HPLC-MS技术，对四君子汤水煎液及含药血清进行检测，得到总离子流图以及质谱的碎片峰，推测出四君子汤水煎液中含有10种化学物质，其中皂苷类7种，分别为人参皂苷Rb1、Re、Rg1、Rb2、Rd、Rg3、甘草酸；黄酮类3种，分别为甘草苷、甘草素、甘草香豆素。人参皂苷Rb1、Re、Rg1以及甘草酸是药典中规定人参及甘草中所必需有的化学成分，也是四君子汤中的4种指标性成分。含药血清中有人参皂苷Rb1、Re和甘草酸3种原型化学成分，以及甘草次酸、甘草素葡萄糖醛酸两种代谢成分(均由甘草酸水解产生)。

本实验采用水提方法模拟传统汤剂处方煎煮，由于茯苓中的萜类、有机酸类及白术中的内酯类均不溶于水，故无法检测到茯苓和白术中的相关化合物；同时说明通过传统的煎煮法，茯苓和白术的有效成分亦无法完全释放出来。由此证实，四君子汤中的有效成分为人参及甘草，其中人参以原型化合物，而甘草则以水解产物的代谢形式存在于在血液中。