模拟浓香型白酒窖内发酵过程中主要挥发性物质的变化研究

张建敏，赵 东，郑 佳，彭志云，杨康卓，刘 芳

(宜宾五粮液股份有限公司技术研究中心，四川宜宾644007)

浓香型白酒窖内发酵过程是一种多菌种参与的固态发酵过程。来自曲药、窖泥及发酵环境的多种微生物（细菌、酵母和霉菌）以酒醅为载体，在白酒窖内发酵过程中进行复杂的物质能量代谢，生成各类代谢产物和风味物质。糟醅的发酵过程不仅仅包含了曲药微生物在窖池内从有氧发酵到厌氧发酵的过程，同时包含了曲药微生物与窖泥微生物在糟醅与窖泥接触的界面上的相互代谢作用[1-3]。五粮浓香的双轮底发酵，极大程度延长了窖池内窖泥与糟醅的厌氧接触时间，糟醅与窖泥间营养物质、微生物的交换，形成了“以窖养糟、以糟促窖、糟窖互养”的良好互动局面[4-5]。传统的酿酒经验告诉我们，窖池边糟（即糟醅与窖泥接触部分的糟醅）中的风味物质的浓度显著高于中心糟（未与窖泥接触的糟醅）。然而，迄今还没有开展糟醅微生物与窖泥微生物的相互代谢关系的研究。

为了解析浓香型白酒窖内发酵过程糟醅微生物与窖泥微生物的相互代谢关系，本研究模拟白酒窖内糟醅发酵情况，以五粮粉液体培养基作为载体，添加窖泥富集菌液与生产用曲粉，梯度培养并按设置节点取样，并利用气质联用仪分析发酵过程中主要风味物质，以期确定主要风味物质的动态变化规律，并找到糟醅微生物与窖泥微生物的相互代谢关系。通过模拟发酵解析酒醅发酵过程中主要风味物质的动态变化关系，可为后续实验阐明酒醅中微生物产风味物质机理，定向调控白酒生产中的主要风味物质的合成提供理论依据和实践参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

原料：五粮粉制备参考文献[6]，窖泥富集液制备参考文献[7]。

接种、培养及取样方式见表1。

主要仪器与试剂：立式高压蒸汽灭菌锅为YXQ-LS，购自上海博讯实业有限公司；生物安全柜为ESCO Class II，购自珠海市珠峰仪器仪表有限公司；气质联用仪为6890N-5973MSD，购自安捷伦科技有限公司；二氯甲烷为ACS级，购自北京百灵威科技有限公司；4-辛醇为GC级，购自阿拉丁试剂有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 液液微萃取法(LLME)

准确量取15 mL发酵过滤液于试管中，加入适量NaCl饱和，再加入1.5 mL重蒸CH2Cl2，振荡萃取10 min，静置一段时间，吸取1.5 mL萃取物离心，吸取下层萃取物0.5 mL。

1.2.2 GC-MS分析条件

GC条件：DB-Wax（30.0 m长×0.25 mm内径×0.25 μm膜厚，J&W，美国）毛细管色谱柱；进样口温度250℃，不分流进样，载气He流速1 mL/min；升温程序：起始温度40℃，保持5 min，以4℃/min升至230℃，保持15 min。

MS条件：EI源，电子能量70 eV；离子源温度200℃，四级杆温度150℃，质量数扫描范围35～350 amu。

1.2.3 化合物鉴定与半定量分析

化合物鉴定采用参考文献[8]所述方法进行化合物定性；单个化合物的相对含量采用其与内标响应值的比进行半定量分析。

2 结果与分析

2.1 发酵结束时挥发性成分总离子流图（图1）

本研究利用LLME法提取发酵液中的香气成分，不同发酵液的色谱图差异较明显（图1）。半定量风味物质共26种，包括醇类7种、酸类6种、酯类12种、酮类1种，其占总量比分别为72.17%、5.97%、21.55%、0.31%，且均为白酒基酒中已检出的化合物。由此说明在模拟发酵体系下1#、2#、3#发酵结束时，所产最多的挥发性物质均为醇类，其次为酯类，出现这种情况可能与培养基质偏酸更适合酵母生长有关。由图2可知，1#、2#、3#所半定量的主要挥发性物质总量的比值为3.3∶1.5∶1，2#与3#的挥发性物质的热图聚为一簇，说明两者之间的风味风格有一定的相似性。

2.2 醇类

表1 接种、培养及取样方式

本研究中，醇类化合物7种，包括苯乙醇、异戊醇、异丁醇、正己醇、正丙醇、正丁醇、3-甲基-2-丁醇，其占醇类比重分别为73.95%、23.68%、2.11%、0.20%、0.03%、0.02%，均为白酒基酒中已检出化合物。发酵过程中的优势醇类（苯乙醇、异戊醇、异丁醇、正己醇）在发酵中整体呈现一个积累增加的过程（图3）。发酵结束时，发酵液中优势醇含量的积累量比值为1#∶2#∶3#=3.9∶1.7∶1，说明大曲粉的微生物代谢五粮粉培养基产生的醇类物质最多。这是由于大曲粉中酵母菌的数量显著多于2#，因而1#发酵液中优势醇类积累量远高于2#；2#发酵液中也有相当量优势醇的积累，这可能是由于窖泥长期与糟醅接触，两者中微生物的互动致使糟醅中的酵母进入窖泥，从而形成一定的产醇能力。值得注意的是，3#发酵液中优势醇类积累量均少于1#和2#，减少幅度分别为289.32%和70.61%，说明混菌培养时，优势醇类的积累量受到很大程度的抑制，但抑制的机理仍待进一步探讨。由于醇类物质具有典型的水果香、花香味[9]，不仅是酒中醇甜和助香剂的主要物质，也是形成香味物质的前驱物质，对白酒的风味有一定的作用，但是其含量必须控制在一定范围内。含量过少会失去传统白酒的风格，过多会导致产品辣、苦、涩，给酒带来不良的影响[10]。所以，在浓香型白酒酿造过程中对醇类物质的调控显得尤为重要。

图1 发酵结束主要物质总离子流图

图2 发酵结束时主要物质热图

图3 发酵过程中优势醇类含量变化趋势

图4 发酵过程中四大酸含量变化

图5 发酵过程中四大酯含量变化

2.3 酸类

酸类物质既是白酒的主要协调成分，也是重要的呈味物质，还是酒中酯类的前体物质。白酒中酸量过少，酒味寡淡，后味短；酸量过大，酸味露头，酒味粗糙，甚至入口有尖酸味；适量的有机酸可使酒体丰满、醇厚，回味悠长[11]。

本研究中定量检测了6种酸类化合物，包括乙酸、辛酸、己酸、庚酸、3-甲基丁酸和丁酸，占酸类比重分别为64.96%、17.12%、8.81%、4.70%、3.23%和1.18%，且均为白酒中常见的有机酸。对发酵过程中的优势酸类（乙酸、辛酸、己酸、庚酸）的定量结果可知，发酵液中优势酸在发酵过程中也呈增加的的趋势（图4）。发酵结束时，发酵液中优势酸含量的积累量比值为1#∶2#∶3#=2.5∶4.2∶1。由于窖泥中的绝对优势微生物为细菌，大部分为产酸细菌[11]，使得2#发酵液中优势酸积累量远高于1#；1#发酵液中也有一定量优势酸的积累，这可能是大曲发酵液中含有细菌产酸所致；3#发酵液中优势酸积累量均少于1#和2#，减少幅度分别达到149.65%和318.35%，说明混菌培养时，优势酸的积累量也受到很大程度的抑制，但抑制的机理仍不清楚。

2.4 酯类

棕榈酸乙酯、乳酸乙酯、亚油酸乙酯、十四酸乙酯是主要的酯类物质，其占酯类比重分别为37.76%、34.07%、9.70%、9.27%。主要乙酯在发酵中的变化趋势与酸、醇的变化结果基本一致（图5）。发酵结束时，主要乙酯的积累量比值为1#∶2#∶3#=2.3∶0.9∶1。大曲粉中含有大量的酵母菌，另外，制曲的原料是小麦，小麦本身含有大量的棕榈酸、油酸等，在大曲粉发酵过程中，酵母菌所含的酯化酶系可将乙醇和这类有机酸酯化产生相应的乙酯，使得主要乙酯含量高于2#；3#发酵液中主要乙酯积累量少于1#（-132.01%），而与2#基本持平，说明当大曲微生物与窖泥微生物混合培养时，大曲粉中酵母菌的酯化能力受到一定程度的抑制。

3 结论

本研究利用LLME-GC/MS探讨了大曲微生物与窖泥微生物在模拟发酵体系中主要挥发性物质的变化规律，研究结果表明，在模拟发酵体系中大曲微生物、窖泥微生物、混合发酵所产主要挥发性物质是醇类。混菌培养条件下发酵液中酸类、醇类、酯类的积累均受到相当大程度的抑制。风味物质与微生物群落间的关联性以及窖池内微生物的代谢规律特征将是我们后续研究工作的重点。