LC-ESI-MS/MS测定白酒中甜味剂三氯蔗糖的方法研究

周 玉，唐艳荣，余 义，刘 莎，毛从兴，郑 静，孙 琳，刘 艳，时宏伟

(武汉天龙黄鹤楼酒业有限公司，湖北武汉430050)

随着社会发展和科技进步,人们越来越重视饮食健康问题,其中三氯蔗糖制作的甜味剂应用范围较为广泛。三氯蔗糖的主要原材料是蔗糖,并且在氯代作用下获取非营养型的强力甜味剂。甜味剂是白色的粉末状物质,极易溶于水,水溶液透明,实际甜度能够达到蔗糖的400～800倍。为此,对于甜味剂三氯蔗糖合成工艺展开进一步的分析具有一定的现实意义[1-3]。甜味剂尽管应用范围很广，但是在白酒中是不允许添加的[5]。

白酒是我国的传统蒸馏酒，按其风味特征可分为各种不同的香型，虽然每种香型各有其典型风格，但是不论哪种香型的白酒，保持适度的甜味，不仅可以遮盖其他一些苦涩杂味，而且还能使酒体甘洌、醇厚、绵软，但是这种甜味是来自于自然发酵产生的，而非添加甜味剂。风味化学研究表明，味觉是由一定的呈味物质引起的，酒之所以具有醇甜之感，是因为酒中含有一定量的甜味物质，如高级醇、多元醇、氨基酸等，这些甜味物质，对于名优白酒，是由其特殊的生产工艺决定的，如浓香型大曲酒的低温入池、缓慢发酵，就是为了有利于醇甜物质的生成，无需另行添加[8]。

人工合成甜味剂可能对人体有致癌、致病的副作用[6]，因而已被许多国家限制使用。尤其在白酒行业，《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》GB 2760—2014中规定白酒中甜味剂不得检出。所以对于白酒中甜味剂的测定应做到严格把关，防止白酒行业中出现假冒伪劣产品，对消费者产生不利影响。目前，关于三氯蔗糖的检测方法主要有液相色谱-质谱联用法[9-10]、高效液相色谱法[4-5]、高效液相色谱蒸发散射法[12]、高效毛细管电泳-间接紫外法[18]、核壳型色谱柱-反相高效液相色谱-蒸发光散射检测法[19]、紫外衍生-高效液相色谱法[21]。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

酒样：市售白酒样品4种。

试剂及耗材：三氯蔗糖（规格1 g，储存温度2～8℃，日本和光纯药工业株式会社）；甲醇（色谱纯，美国Baker公司）；乙酸铵（分析纯，天津市天力化学试剂有限公司）；蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司，规格600 mL）。

仪器设备：Agilent 1260LC-Agilent 6460安捷伦三重串联四级杆质谱仪(安捷伦科技有限公司）；Agilent ZORBAX RX-C18安捷伦色谱柱（4.6×250 mm，5 μm，安捷伦科技有限公司）；有机滤膜(孔径0.22 μm，天津津腾)；全玻璃微孔过滤器(规格1000 mL，天津津腾实验设备有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制

准确称取10 mg(精确至0.0001 mg)三氯蔗糖标准品于100 mL容量瓶中，用蒸馏水溶解并定容至100 mL)，配制成100 mg/L的标准储备液，置于4℃冰箱中保存。根据使用需要，用蒸馏水逐级稀释成适当浓度的混合标准工作液。

1.2.2 样品前处理方法

用一次性注射器吸取均质样品，经0.22 μm的有机滤膜过滤，滤液供液相色谱-质谱联用仪测定。

1.2.3 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX RX-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：A为0.02 mol/L乙酸铵溶液，B为甲醇；流动相体积比A∶B=30∶70；流速：0.4 mL/min；柱温箱：25 ℃；进样量：2 μL。

1.2.4 质谱条件

离子源：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描；检测方式：多反应检测模式；干燥气体温度：325℃；干燥气体流速：6 L/min；喷雾电压：206.8 kPa。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件和质谱条件的优化

2.1.1 质谱条件的优化

采取直接进样的方式，将目标物标准溶液注入质谱，分别进行正离子模式和负离子模式全扫描检测，得到一级质谱图和准分子离子峰，再用惰性气体氮气攻击该母离子，获得其二级质谱图及相应的子离子。结果表明，在负离子模式下响应值及灵敏度均高于正离子模式，因此，本方法选择负离子电离模式。利用多反应监测模式（MRM）对选定的定性离子和定量离子对碎裂电压、碰撞能、保留时间、碰撞池加速电压等质谱参数进行优化，使各监测离子丰度和信号达到最佳。负离子模式下的质谱分析参数见表1。

2.1.2 色谱条件的优化

分别以0.1%乙酸-甲醇、0.1%乙酸-乙腈、2 mmol/L乙酸铵-甲醇作为流动相进行样品分离。结果表明，用2 mmol/L乙酸铵-甲醇作为流动相时物质分离度、峰形、响应值以及保留时间的稳定性均优于0.1%乙酸-乙腈、0.1%乙酸-甲醇，故本方法最终选用2 mmol/L乙酸铵-甲醇为流动相进行洗脱。图1是三氯蔗糖在优化的色谱和质谱条件下的MRM色谱图。

表1 三氯蔗糖的质谱参数

图1 三氯蔗糖的多反应监测色谱图

2.2 线性范围、检出限和定量限

线性范围、检出限和定量限参照吕谦、杨小玉、王玉红等[15-19]的方法，将三氯蔗糖标准储备液用蒸馏水稀释，分别配制成浓度为40 μg/L、80 μg/L、160 μg/L、400 μg/L、800 μg/L的5种标准工作液，按1.2节所述的色谱-质谱条件进行测定，绘制标准工作曲线（图2）。

图2 三氯蔗糖的线性相关系数

结果显示，在40～800 μg/L的浓度范围，所有分析物的质量浓度x(ng/mL)和响应值y之间线性相关系数为0.99999；以性噪比为3确定检出限为40 μg/L，以性噪比为10确定定量限为100 μg/L。

2.3 精密度和回收率

精密度和回收率参照韩秋珍、陈璐莹、刘亚攀等[20-21]的方法，采用在空白样品中添加标准溶液的方法，选择常见的浓香型和兼香型两个不同香型白酒酒样及乙醇进行三氯蔗糖检测试验，成品白酒1、白酒2和乙醇3的三氯蔗糖含量均为未检出，并向两个样品中分别添加浓度为200 μg/L、400 μg/L的三氯蔗糖进行回收率实验，重复测定2次。共6组平行，12次检测，结果表明，在重复性条件下获得的两次独立测定结果的相对偏差小于2%，且回收率均在85%～105%范围内，所以该方法的精密度和回收率均符合相关标准要求。

2.4 与国标法比对

选择常见的4种不同类型白酒酒样添加三氯蔗糖，将本方法与国标GB 22255—2014《食品安全国家标准食品中三氯蔗糖（蔗糖素）的测定》方法进行加标测回收率结果比对，比对结果见表2。

将本方法和国标方法的数据进行比较，两组数据的绝对偏差小于1，相对偏差小于5%。国标方法中三氯蔗糖的定量限是2.5 mg/L；本方法的检出限是0.04 mg/L，定量限是0.1 mg/L。结果表明，本方法可以用于白酒中三氯蔗糖的检测。相比液相色谱系统，液相质谱联用仪具有更高的分离度和灵敏度以及更短的检测时间。

3 结论

本研究利用液相色谱-质谱联用仪分析了白酒中甜味剂三氯蔗糖化合物的分子信息，利用多反应监测模式的液相色谱-质谱联用仪技术，建立了一个快速、稳定、灵敏的可定性定量检测三氯蔗糖的方法。该方法可在10 min内完成，其检测范围内线性良好（r=0.99999），检出限0.04 mg/L，定量限0.1 mg/L，精密度＜2%，回收率＞85%，且与国标中的检测方法相比检出限更低，能更加有效的监测白酒中三氯蔗糖的含量，综上所述，该方法可以对三氯蔗糖进行实际的定性定量检测。

表2 方法结果比对