外源性胆红素对缺血缺氧性脑损伤大鼠认知功能及海马组织中蛋白酪氨酸激酶2/信号转导子与激活子3/B细胞淋巴瘤基因-2通路的影响

侯立维，孔丽娜，杜开先

(1.郑州大学第二附属医院神经内科，河南 郑州 450014；2.郑州大学第三附属医院小儿神经内科，河南 郑州 450052)

缺血缺氧性脑损伤是围生期常见的疾病[1-2]，是造成新生儿死亡及神经系统损伤的主要原因之一，其致死率和致残率高，严重威胁新生儿的生命[3-4]。地塞米松是治疗缺血缺氧性脑损伤的常用药物，但长期使用会引发肌无力、肌萎缩，甚至影响幼儿骨骼生长和发育[5]。胆红素是一种抗氧化剂，对癌症、心脑血管疾病及神经性疾病具有防治作用[6-7]。然而，外源性胆红素对缺血缺氧性脑损伤大鼠认知功能的影响尚未见报道。本研究以地塞米松为阳性对照药物，探讨外源性胆红素对缺血缺氧性脑损伤大鼠认知功能及海马组织中蛋白酪氨酸激酶2 (janus activated kinase-2，JAK2)/信号转导子与激活子3(signaltransducer and activator of transcription-3，STAT3)/B细胞淋巴瘤基因-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)/信号通路的影响，旨在为缺血缺氧性脑损伤的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1实验动物无特定病原体级7日龄雄性Wistar大鼠72只，体质量11.5～16.4 g，购自中国农业大学实验动物中心，许可证号：SYXK(京)2015-0045。采用随机数字表法将大鼠分为假手术组、模型组、地塞米松组、外源性胆红素低剂量组、外源性胆红素中剂量组、外源性胆红素高剂量组，每组12只，在室内温度18～25 ℃、相对湿度为40%～50%的动物实验房内饲养，自由进食、进水，食物为全价营养颗粒饲料，2 d更换垫料1次。

1.2主要试剂与仪器胆红素、地塞米松购自中国药品生物制品检验所，辣根过氧化物酶购自上海倍卓生物科技有限公司，兔抗鼠p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG二抗购自武汉博士德生物工程有限公司，末端脱氧核苷酸转移酶介导的 dUTP 缺口末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)试剂盒购自杭州碧云天生物技术有限公司，二氨基联苯胺 (diaminobenzidine，DAB) 显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)购自美国Abcam公司；3K15超低温离心机购自德国Sigma公司；SW-CJ-2D2G2F2FD双人净化工作台购自苏州净化设备有限公司，精密电子天平购自美国Adventurer公司，紫外分光光度计购自上海第三分析仪器厂。

1.3动物模型制备采用经典Rice法制备缺血缺氧性脑损伤大鼠模型[8]：将各组大鼠腹腔注射40 g·L-1水合氯醛进行麻醉，剪毛消毒后，将其固定于脑立体定位仪上，沿颈中线切口，分离左侧颈总动脉，用5/0丝线结扎颈外动脉(假手术组只穿线不结扎)，缝合组织及皮肤，待大鼠苏醒后回笼饲养。模型制备4 h后，地塞米松组大鼠腹腔内注射 10 mg·kg-1地塞米松[9]；外源性胆红素低、中、高剂量组大鼠分别腹腔内注射5、10、15 mg·kg-1外源性胆红素[10]，假手术组、模型组大鼠腹腔内注射等量的生理盐水，连续给药2周。

1.4Morris水迷宫实验检测各组大鼠认知功能治疗2周后，采用Morris水迷宫实验检测各组大鼠空间位置学习记忆能力[11]，实验期间保持平台位置不变，环境安静，四周光照程度一样，水池壁上黄色胶布标记，室温和水温均控制在22～26 ℃。(1)定位航行实验：将大鼠置于圆形不锈钢水池，任意选2个与平台等距的入水点，将动物面朝池壁轻轻放入水中，记录大鼠90 s内寻找平台时间(逃避潜伏时间)，实验第1、2、3、4天每天训练2次，2次训练潜伏时间的平均值记为当天逃避潜伏时间。(2)空间探索实验：第5天撤走安全平台，随机选取入水点，将大鼠放入水中，记录大鼠90 s内找到目标象限穿越平台次数及探索平台的速度，实验只进行1次，并以此数据作为空间学习记忆能力的检测指标。

1.5TUNEL法检测各组大鼠海马组织中细胞凋亡情况水迷宫实验结束后，每组随机选取5只大鼠，采用10 g·L-1水合氯醛(4 mL·kg-1)腹腔注射麻醉，于无菌条件下打开胸腔，暴露心脏，使用40 g·L-1多聚甲醛灌注固定，直至心脏变白、四肢僵硬，迅速断头取脑，一部分脑组织保存于-80 ℃冰箱中，另一部分脑组织置于体积分数10%的中性甲醛溶液中固定4 h。参照文献中大鼠脑立体定位图谱取其海马组织[12]，制作石蜡切片，脱蜡、脱水后添加DNA 断裂的TUNEL反应液，37 ℃避光孵育 1 h，清洗后添加 50 μL辣根过氧化物酶，37 ℃避光孵育30 min，清洗后添加DAB显色液，室温孵育 5 min，期间观察组织切片染色情况，用单蒸水终止显色。经梯度乙醇水合、二甲苯透明、中性树胶封片，光学显微镜下观察各组切片显色情况。正常神经元经苏木精复染后细胞核呈蓝黑色，TUNEL阳性细胞的细胞体缩小，核固缩，染色质凝聚，呈棕黄色或黄褐色颗粒，表现出凋亡的特征。采用Image ProPlus 5.1软件分析每张照片，计算凋亡细胞数，每张切片取5个不同视野进行观察，计算细胞凋亡率，细胞凋亡率=TUNEL阳性细胞数量/总细胞数量×100%。

1.6Westernblot法检测各组大鼠海马组织中p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2蛋白表达取脑组织，研磨后加入裂解液提取海马组织总蛋白，以GAPDH为内参，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，每孔上样体积 20 μL，电泳结束后，半干转膜仪转膜50 min，分别滴加一抗兔抗鼠p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2多克隆抗体，4 ℃过夜，滴加二抗，37 ℃ 放置1 h。显影后采集图像，以β-actin为内参蛋白，采用Gel-Pro analyzer 4软件定量分析p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2蛋白表达水平。

2 结果

2.16组大鼠逃避潜伏时间比较结果见表1。与假手术组比较，模型组大鼠第1、2、3、4天逃避潜伏时间均显著延长，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，地塞米松组和外源性胆红素低、中、高剂量组大鼠第1、2、3、4天逃避潜伏时间均显著缩短，差异有统计学意义(P<0.05)。与地塞米松组比较，外源性胆红素低、中剂量组大鼠第1、2、3、4天逃避潜伏时间显著延长(P<0.05)。外源性胆红素高剂量组大鼠第1、2、3、4天逃避潜伏时间与地塞米松组比较差异无统计学意义(P>0.05)。随着外源性胆红素剂量增加，外源性胆红素低、中、高剂量组大鼠第1、2、3、4天逃避潜伏时间呈缩短趋势，组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。

表16组大鼠逃避潜伏时间比较

组别n逃避潜伏时间/s第1天第2天第3天第4天假手术组1245.16±4.3634.18±4.1321.32±3.4313.58±3.02模型组12121.43±8.56a108.13±8.35a101.75±8.06a85.26±7.73a地塞米松组1257.71±5.73b48.52±6.12b40.16±4.02b25.43±3.56b外源性胆红素低剂量组1299.54±8.15bc86.72±7.82bc80.71±7.63bc63.21±5.45bc外源性胆红素中剂量组1277.43±7.41bcd66.03±5.61bcd59.36±5.24bcd42.53±4.03bcd外源性胆红素高剂量组1258.78±6.52bde47.21±4.32bde38.87±3.91bde24.46±3.75bde

注：与假手术组比较aP<0.05；与模型组比较bP<0.05；与地塞米松组比较cP<0.05；与外源性胆红素低剂量组比较dP<0.05；与外源性胆红素中剂量组比较eP<0.05。

2.26组大鼠探索平台情况比较结果见表2。与假手术组比较，模型组大鼠穿越平台次数及探索平台速度均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，地塞米松组和外源性胆红素低、中、高剂量组大鼠穿越平台次数及探索平台速度显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)。与地塞米松组比较，外源性胆红素低、中剂量组大鼠穿越平台次数及探索平台速度均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。外源性胆红素高剂量组与地塞米松组大鼠穿越平台次数及探索平台速度比较差异无统计学意义(P>0.05)。随着外源性胆红素剂量增加，外源性胆红素低、中、高剂量组大鼠穿越平台次数及探索平台速度呈增加趋势，组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.36组大鼠海马组织中细胞凋亡情况比较假手术组、模型组、地塞米松组及外源性胆红素低、中、高剂量组大鼠海马组织中细胞凋亡率分别为(7.32±1.78)%、(58.42±2.78)%、(15.13±1.93)%、(42.36±2.54)%、(27.53±2.23)%、(15.42±1.97)%。与假手术组比较，模型组大鼠海马组织中细胞凋亡率显著增高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，地塞米松组和外源性胆红素低、中、高剂量组大鼠海马组织中细胞凋亡率均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与地塞米松组比较，外源性胆红素低、中剂量组大鼠海马组织中细胞凋亡率均显著增高，差异有统计学意义(P<0.05)。高剂量组与地塞米松组大鼠海马组织中细胞凋亡率比较差异无统计学意义(P>0.05)。随着外源性胆红素剂量增加，外源性胆红素低、中、高剂量组大鼠海马组织中细胞凋亡率呈降低趋势，组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1。

表26组大鼠探索平台情况比较

组别n穿越平台次数 探索平台速度/(cm·s-1)假手术组128.94±1.13 28.76±1.41 模型组123.02±0.63a23.42±0.61a地塞米松组127.56±1.06b27.36±1.03b外源性胆红素低剂量组124.52±0.78bc24.07±0.76bc外源性胆红素中剂量组126.11±0.86bcd25.13±0.83bcd外源性胆红素高剂量组127.53±1.03bde27.24±0.97bde

注：与假手术组比较aP<0.05；与模型组比较bP<0.05；与地塞米松组比较cP<0.05；与外源性胆红素低剂量组比较dP<0.05；与外源性胆红素中剂量组比较eP<0.05。

A：假手术组；B：模型组；C：地塞米松组；D：外源性胆红素低剂量组；E：外源性胆红素中剂量组；F：外源性胆红素高剂量组。

图16组大鼠海马组织中细胞凋亡情况(TUNEL法，×400)

Fig.1Apoptosisinhippocampusofratsinthesixgroups(TUNEL，×400)

2.46组大鼠海马组织中p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2蛋白表达水平比较结果见表3和图2。与假手术组比较，模型组大鼠海马组织中p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2表达水平均显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，地塞米松组和外源性胆红素低、中、高剂量组大鼠海马组织中p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2表达水平均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与地塞米松组比较，外源性胆红素低、中剂量组大鼠海马组织中p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2表达水平均显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。外源性胆红素高剂量组与地塞米松组大鼠海马组织中p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。随着外源性胆红素剂量增加，外源性胆红素低、中、高剂量组大鼠海马组织中p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2表达水平呈现降低趋势，组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。

表36组大鼠海马组织中p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2蛋白表达比较

组别np-JAK2 p-STAT3 Bcl-2 假手术组50.28±0.03 0.42±0.04 0.21±0.01 模型组50.92±0.08a1.15±0.12a0.98±0.10a地塞米松组50.32±0.03b0.52±0.05b0.40±0.03b外源性胆红素低剂量组50.73±0.07bc0.94±0.09bc0.79±0.08bc外源性胆红素中剂量组50.54±0.06bcd0.73±0.07bcd0.59±0.06bcd外源性胆红素高剂量组50.34±0.04bde0.51±0.05bde0.38±0.06bde

注：与假手术组比较aP<0.05；与模型组比较bP<0.05；与地塞米松组比较cP<0.05；与外源性胆红素低剂量组比较dP<0.05；与外源性胆红素中剂量组比较eP<0.05。

1：假手术组；2：模型组；3：地塞米松组；4：外源性胆红素低剂量组；5：外源性胆红素中剂量组；6：外源性胆红素高剂量组。

图26组大鼠海马组织中p-JAK2、p-STAT3和Bcl-2蛋白的表达(Westernblot)

Fig.2Expressionofp-JAK2，p-STAT3andBcl-2proteininhippocampusofratsinthesixgroups(Westernblot)

3 讨论

缺血缺氧性脑损伤是临床常见的神经系统疾病，常引发脑水肿、脑组织坏死以及神经损伤，导致患者认知功能障碍，如记忆力减退、运动功能及学习能力减退等[13-14]，甚至危及患者生命。因此，探寻安全、高效的药物治疗缺血缺氧性脑损伤具有重要意义。

胆红素是哺乳动物体内的代谢终产物，研究显示，胆红素具有抗菌消炎、抗癌、抗氧化、抗神经细胞凋亡等多种药理功能[15]。MIRELES等[16]研究表明，外源性胆红素可避免红细胞氧化反应时结构损伤。万英等[10]研究表明，外源性胆红素能够减轻急性肾缺血再灌注损伤，发挥对肾组织的保护作用。侯立维等[17]研究表明，外源性胆红素能够减轻缺血缺氧性脑损伤大鼠神经细胞凋亡，对缺血缺氧性脑损伤神经起保护作用。ADIN等[18]研究表明，外源性胆红素在胰岛分离和低氧应激小鼠中表现出细胞保护和抗氧化作用。然而，胆红素对缺血缺氧性脑损伤大鼠认知功能及海马神经细胞凋亡的影响尚未见报道。

本研究结果显示，与模型组比较，地塞米松组和外源性胆红素低、中、高剂量组大鼠逃避潜伏时间显著缩短，穿越平台次数、探索平台速度显著提高，海马组织中细胞凋亡率显著降低；与地塞米松组比较，外源性胆红素低、中剂量组大鼠逃避潜伏时间显著延长，穿越平台次数及探索平台速度均显著降低，海马组织中细胞凋亡率显著升高，而外源性胆红素高剂量组大鼠与地塞米松组比较逃避潜伏时间、穿越平台次数、探索平台的速度以及海马组织中细胞凋亡率差异均无统计学意义；且随着外源性胆红素剂量增加，外源性胆红素低、中、高剂量组大鼠各时间点大鼠逃避潜伏时间呈缩短趋势，穿越平台次数及探索平台速度呈增加趋势，海马组织中细胞凋亡率呈现降低趋势，组间两两比较差异均有统计学意义。以上结果提示，外源性胆红素能够改善缺血缺氧性脑损伤大鼠的认知功能，并抑制海马组织中细胞凋亡，且具有一定的剂量依赖性。

外源性胆红素能够抑制海马细胞凋亡，但具体的作用机制尚未完全明确。JAK2、STAT3、Bcl-2是与细胞凋亡密切相关的蛋白，JAK2/STAT3/Bcl-2通路在细胞凋亡过程中发挥着重要作用。有研究显示，胆红素可下调凋亡蛋白表达水平，增强Bcl-2活性，增大Bcl-2/Bax比值，在缺血再灌注过程中抑制神经元凋亡[19]。邓士兵等[20]研究表明，通过调控JAK2/STAT3/Bcl-2信号通路的活性，能够抑制心肌细胞凋亡。鲍天昊等[21]研究表明，上游的JAK2蛋白分子与细胞表面的受体结合后，能够诱导受体和JAK2磷酸化，活化的JAK2分子能够诱导下游的STAT3发生磷酸化，STAT3被活化后进入到细胞核内，激活转录的发生，进而调控抗凋亡蛋白Bcl-2表达。本研究结果显示，与模型组比较，地塞米松组和外源性胆红素低、中、高剂量组大鼠海马组织中p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2蛋白表达水平显著降低；与地塞米松组比较，外源性胆红素低、中剂量组大鼠海马组织中p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2表达水平均显著升高，而大鼠高剂量组海马组织中p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2表达差异均无统计学意义，且随着外源性胆红素剂量增加，外源性胆红素低、中、高剂量组大鼠海马组织中p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2表达水平呈下降趋势，组间两两比较差异均有统计学意义。以上结果提示，外源性胆红素通过调控p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2表达来调控海马细胞凋亡。

综上所述，外源性胆红素能够提高缺血缺氧性脑损伤大鼠的认知功能，抑制海马组织细胞凋亡，这一作用可能是通过调控JAK2/STAT3/Bcl-2通路的活性而实现。