乳腺浸润性导管癌组织中肽基脯氨酰顺反异构酶1和细胞周期蛋白D1的表达及临床意义

吴晓明，韩 华，吴煌福

(海南医学院第二附属医院肿瘤外科，海南 海口 570311)

乳腺癌是常见的恶性肿瘤，发病率居女性恶性肿瘤第1位。乳腺癌是一种激素依赖的全身性疾病，雌激素受体与乳腺癌发病具有显著的相关性，雌激素受体拮抗剂可显著降低乳腺癌复发率，雌激素是已知的乳腺细胞促分裂因子，去除雌激素可抑制乳腺癌的发展[1]。细胞周期蛋白是细胞增殖周期重要的调控因子，研究表明，雌激素可能通过细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)介导其增殖作用[2-3]。肽基脯氨酰顺反异构酶1(peptidyl-prolyl cis-trans-isomerase 1，Pin1)是一种肽酰脯氨基顺反异构化催化酶，能使蛋白质序列中磷酸化的丝氨酸苏氨酸-脯氨酞键异构化，由顺式变为反式，参与磷酸化蛋白质活性的调节，诱导磷酸化蛋白质的去磷酸化，调节磷酸化蛋白质间的相互作用，改变磷酸化蛋白质的稳定性和亚细胞定位，与细胞增殖和转化相关[4-5]。研究显示，Pin1过表达与宫颈癌的发生、发展有关[6]。本研究旨在观察乳腺浸润性导管癌组织中Pin1和Cyclin D1的表达，探讨Pin1和Cyclin D1与乳腺浸润性导管癌发生、发展的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料选取2013年1月至2015年1月海南医学院第二附属医院保存的乳腺浸润性导管癌组织80例，患者均为女性，年龄37～74岁(55.79±9.71)岁；肿瘤组织病理学分级：G1级23例，G2级35例，G3级22例；淋巴结转移51例，无淋巴结转移29例；TNM分期：Ⅰ期29例，Ⅱ期23例，Ⅲ期28例；所有患者病理学检查前未进行化学治疗及放射治疗。同时选取女性癌旁正常乳腺组织标本40例作为对照，患者年龄38～75(54.79±11.12)岁。2组患者的年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。乳腺浸润性导管癌组织和正常乳腺组织经甲醛固定，石蜡包埋保存。本研究经过医院伦理委员会批准，所有患者签署知情同意书。

1.2主要试剂与仪器Pin1小鼠抗人抗体、Cyclin D1小鼠抗人抗体(美国Santa Cruz)，免疫组织化学试剂盒(南京建成生物科技有限公司)；CX23显微镜(日本Olympus公司)，RM2235切片机(德国Leica公司)。

1.3免疫组织化学法检测乳腺浸润性导管癌组织和正常乳腺组织中Pin1和CyclinD1表达取石蜡标本，切片，60 ℃烤片；二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化；体积分数3%过氧化氢溶液室温10 min，以消除内源性过氧化物酶；磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)冲洗3次，每次5 min；微波抗原修复10 min，PBS冲洗3次，每次5 min；山羊血清封闭组织30 min，孵育一抗(CyclinD1稀释比例为1100稀释，稀释比例为Pin1 1200稀释)，4 ℃孵育过夜，冲洗3次，每次5 min；加入二抗，孵育30 min；PBS冲洗3次，每次5 min；二氨基丁酸显色5～10 min，PBS冲洗10 min；苏木精复染2 min，梯度乙醇脱水，透明，中性树胶封片。以PBS替代一抗作为阴性对照，光学显微镜下观察。Pin1和Cyclin D1表达均定位于细胞核，阳性表达为细胞核内呈现棕黄色颗粒。显微镜下随机取4个高倍视野，计算阳性细胞数和苏木精标记细胞数目，细胞阳性表达率=阳性表达细胞数/苏木精标记细胞数×100%。

1.4统计学处理应用SPSS 22.0软件进行统计分析，计数资料比较采用χ2检验，相关性分析采用配对四格表χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1乳腺浸润性导管癌组织和正常乳腺组织中Pin1和CyclinD1的表达结果见图1和图2。乳腺浸润性导管癌组织中Pin1和Cyclin D1阳性表达率分别为56.3%(45/80)、45.0%(36/80)，正常乳腺组织中Pin1和Cyclin D1阳性表达率分别为12.5%(5/40)、20.0%(8/40)；乳腺浸润性导管癌组织中Pin1和Cyclin D1阳性表达率显著高于正常乳腺组织，差异均有统计学意义(χ2=21.001、7.170，P<0.05)。

A：乳腺浸润性导管癌组织；B：正常乳腺组织。

图1乳腺浸润性导管癌组织和正常乳腺组织中Pin1的表达(免疫组织化学，×200)

Fig.1ExpressionofPin1ininvasiveductalcarcinomaofbreastandnormalbreasttissues(immunohistochemistry，×200)

A：乳腺浸润性导管癌组织；B：正常乳腺组织。

图2乳腺浸润性导管癌组织和正常乳腺组织中CyclinD1的表达(免疫组织化学，×200)

Fig.2ExpressionofCyclinD1ininvasiveductalcarcinomaofbreastandnormalbreasttissues(immunohistochemistry，×200)

2.2Pin1和CyclinD1表达与乳腺癌临床特征的关系结果见表1。Pin1表达与乳腺浸润性导管癌病理学分级及淋巴结转移有关(χ2=10.381、4.085，P<0.05)，与TNM分期无关(χ2=2.544，P>0.05)。Cyclin D1表达与乳腺浸润性导管癌病理学分级有关(χ2=7.024，P<0.05)，与TNM分期及淋巴结转移无关(χ2=3.236、0.191，P>0.05)。

表1Pin1和CyclinD1表达与乳腺癌临床特征的关系

Tab.1RelationshipbetweenPin1andCyclinD1expressionandclinicalcharacteristicsofbreastcancer

临床特征nCyclin D1阳性/例(%)阴性/例(%)χ2PPin1阳性/例(%)阴性/例(%)χ2P病理学分级 G1级237(30.4)16(69.6)7(30.4)16(69.6) G2级3514(40.0)21(60.0)7.0240.02921(60.0)14(40.0)10.3810.005 G3级2215(68.2)7(31.8)17(77.3)5(22.7)TNM分期 Ⅰ期2914(48.3)15(51.7)19(65.5)10(34.5) Ⅱ期2313(56.5)10(43.5)3.2360.19913(56.5)10(43.5)2.5440.348 Ⅲ期289(32.1)19(67.9)13(46.4)15(53.6)淋巴结转移 是2914(48.3)15(51.7)21(72.4)8(27.6) 否5122(43.1)29(56.9)0.1910.65924(47.1)27(52.9)4.0850.043

2.3乳腺浸润性导管癌组织中Pin1与CyclinD1表达的相关性结果见表2。乳腺浸润性导管癌组织中Pin1与CyclinD1表达呈正相关(χ2=4.363，P<0.05)。

表2乳腺浸润性导管癌组织中Pin1与CyclinD1表达的相关性

Tab.2CorrelationbetweenPin1andCyclinD1expressionininvasiveductalcarcinomaofbreast

Cyclin D1(+)Cyclin D1(-)χ2PPin1(+)22234.3630.043Pin1(-)1421

3 讨论

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，发病率呈上升趋势，其发病率居女性恶性肿瘤第1位[7]。乳腺癌的发病率虽然很高，但其病因、致病机制尚无定论。有研究认为，乳腺癌是一种全身性疾病，而不是局灶性疾病，乳腺癌的发生涉及细胞增殖和凋亡失衡、分化功能紊乱、基因调控异常及微环境信号传导系统异常等，但其具体发病机制尚不完全清楚[8]。

肿瘤的发生是正常细胞染色体多重损伤的复杂过程，表现为细胞周期失控和细胞分化受阻，细胞周期失控是癌变的重要原因。细胞周期由细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖激酶及细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子等精密调控，细胞周期蛋白起正调节作用[9]。G1/S调控点对细胞周期的调节最为重要，该调控点由Cyclin D1调控。Cyclin D1在细胞增殖中扮演着重要角色，Cyclin D1过表达可缩短细胞G1/S周期，加快细胞增殖，在肿瘤的发生、发展中具有重要意义[10]。Cyclin D1参与多种实体瘤的分子病理机制。Cyclin D1在正常乳腺组织中不表达或低表达，在乳腺癌组织中表达增强[11]。乳腺癌组织中Cyicln D1基因和蛋白的过度表达与雌激素反应元件表达有关[12]。Cyclin D1与雌激素受体阳性表达表现出高度一致，Cyclin D1表达可能受多种因素控制，现已证实，雌激素生长因子可调控CyclinD1的表达[13]。本研究结果显示，乳腺浸润性导管癌组织中Cyclin D1阳性表达率显著高于正常乳腺组织，Cyclin D1表达与乳腺浸润性导管癌病理学分级有关，与TNM分期及淋巴结转移无关。有研究显示，乳腺浸润性导管癌分化越差，Cyclin D1表达越高[14]；提示Cyclin D1表达强度在一定程度上与细胞的恶性倾向有关，检测其表达水平可作为乳腺导管非典型增生组织恶性转化的客观指标。

Pin1是一种肽酰脯氨基顺反异构化催化酶，Pin1特异性地催化蛋白质中磷酸化的Ser/Thr-Pro酰胺键的顺反异构，磷酸化后调控多种蛋白质的功能[15]。Pin1在多种肿瘤中过表达，可加强和催化多种致癌信号使其无限放大，最终引起细胞转化和增殖失控[16]。Pin1在不同肿瘤的进展过程中发挥不同作用，其在乳腺癌和前列腺癌等人类恶性肿瘤中过度表达，Pin1表达水平与乳腺癌的组织病理学分级显著相关，并能预测前列腺癌患者复发的危险性[17]。Pin1在肺癌发生的早期阶段就发挥作用，但对肺癌的侵袭和转移影响不显著[18]。本研究结果显示，乳腺浸润性导管癌组织中Pin1阳性表达率显著高于正常乳腺组织，Pin1表达与乳腺浸润性导管癌病理学分级及淋巴结转移有关；病理学分级越高，Pin1表达越高；有淋巴结转移者的Pin1表达显著高于无淋巴结转移者；但Pin1表达与TNM分期无关。本研究结果显示，乳腺浸润性导管癌组织中Pin1与Cyclin D1表达呈正相关，提示Pinl和Cyclin D1可能相互作用，在乳腺浸润性导管癌中发挥协同促癌作用。

综上所述，Pin1和Cyclin D1在乳腺浸润性导管癌组织中呈高表达，Pin1和Cyclin D1可能发挥协同促癌作用，且Pin1表达与乳腺浸润性导管癌病理学分级及淋巴结转移有关，Cyclin D1表达与乳腺浸润性导管癌病理学分级有关。