五味子乙素抑制晶状体氧化损伤的实验研究

王辉，李璐，刘平，刘娟

随着年龄增加或者日照时间延长，积累性氧化损伤引起过氧化氢（H2O2）过度产生，大量的活性氧（reactive oxygen species,ROS）、羟基自由基及离子代谢产物堆积，导致晶状体上皮细胞凋亡，引发白内障[1]。五味子乙素（schisandrin B,Sch B）由于其具有强大的抗氧化、抗炎、降血糖、改善微循环和抗肿瘤作用而被用于治疗各种全身性疾病[2-3]。然而，关于五味子乙素对白内障大鼠晶状体保护作用的研究并不多见。本研究通过制备氧化损伤诱导的白内障大鼠模型，观察五味子乙素对白内障大鼠晶状体的保护作用，并初步探讨其作用机制，为治疗白内障提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要材料

4周龄清洁级健康雄性Sprague-Dawley大鼠40只，体质量（200±20）g，购自哈尔滨医科大学附属第一医院实验动物研究中心。五味子乙素（中国医学科学院药物研究所），H2O2（上海试剂总厂），血红素加氧酶-1（heme oxygenase 1,HO-1）、核转录因子红系2相关因子 2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf-2）抗体 （上海碧云天公司），Medium 199（M199）培养基 （美国GIBCO公司），手术显微镜（Leica），二喹啉甲酸（bicichoninic acid,BCA）蛋白测定试剂盒、聚偏二氟乙烯 （polyvinylidene fluoride,PVDF）膜及化学发光试剂（上海碧云天公司）。

1.2 实验方法

晶状体分离及培养 实验动物脱臼处死，无菌操作取双侧眼球，生理盐水、青霉素（80万 U/500 mL）及庆大霉素（8万 U/500 mL）冲洗数分钟后，在手术显微镜下用晶状体圈匙游离晶状体组织，置入含有1.5mLM199的24孔培养板中，每孔1只晶状体。

分组处理 随机数字法将晶状体分为4组，每组20只。空白对照组：单纯M199培养基1.5 mL+青霉素及链霉素各300 U；五味子乙素组：空白对照组培养液1.35 mL+5 mmol/L五味子乙素0.15 mL；氧化损伤组：空白对照组培养液1.35 mL+1 mmol/L H2O20.15 mL；氧化损伤+五味子乙素组：氧化损伤组培养液1.35 mL+5 mmol/L五味子乙素0.15 mL。分别在晶状体培养后6 h、12 h及24 h观察晶状体混浊程度并拍照。

晶状体透明度观察记录方法在白色背景下设计粗细一致的十字交叉黑色线条，所检查的晶状体放置在十字交叉处，根据透过晶状体所能看到的线条清晰度进行分级：“-”：晶状体透明，线条清晰可见；“+”：线条增粗，模糊，但是完全可见；“++”：只有晶状体中央部可见线条轮廓。

透射电子显微镜观察晶状体超微结构 培养24 h完成拍照后，每组随机取10只晶状体，手术显微镜下小心撕取晶状体前囊膜，晶状体组织固定于2.5%戊二醛溶液中，4℃冰箱过夜，PBS冲洗后1%四氧化锇后固定，梯度脱水后包埋剂包埋，做超薄切片，柠檬酸铅和醋酸铀染色5 min。

Western blot检测HO-1及Nrf-2的蛋白表达量完成前述晶状体前囊膜取材后，研磨剩余的晶状体组织，RIPA裂解液提取总蛋白后，用BCA蛋白测定试剂盒测定浓度，电泳分离蛋白及转膜后分别加入一抗、二抗，采用增强化学发光法曝光显影并扫描灰度，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）为内参，比较各组HO-1及Nrf-2的相对表达量。

1.3 统计学方法

采用SPSS16.0统计学软件对实验数据进行统计分析。晶状体混浊程度组间比较采用Kruskal-WallisH检验。HO-1及Nrf-2相对表达量以均数±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 晶状体透明度

整体上，各组晶状体透明度均有随时间延长逐渐下降的趋势。同一时间点比较，空白对照组及五味子乙素组差异较小（P＞0.05），培养 6 h、12 h 后以“-”晶状体为主，培养24 h后以“-”“+”为主；氧化损伤+五味子乙素组3个时点的“-”晶状体比例均低于空白对照组及五味子乙素组，但组间差异均无统计学意义（P＞0.05）；氧化损伤组各时点“+”“++”晶状体比例高于其他各组，其中与空白对照组及五味子乙素组的差异最明显（P＜0.05）（表 1）。

图1为培养24 h后，各组典型样本的检查图片。空白对照组及五味子乙素组晶状体透明，可以清晰看到晶状体下方的十字线，氧化损伤组晶状体透明度明显降低，晶状体下方的十字线增粗、模糊，仅晶状体中央部隐约可见线条轮廓，而氧化损伤+五味子乙素组晶状体混浊情况明显轻于氧化损伤组。

2.2 晶状体超微结构

培养后24 h后，透射电子显微镜观察晶状体内超微结构改变。空白对照组及五味子乙素组晶状体上皮细胞胞膜完整连续，核仁形态规则，呈圆形或椭圆形；氧化损伤组晶状体上皮细胞呈弥漫性改变，胞膜残缺不全，胞质内线粒体空泡变性，内质网扩张、裂解，细胞核体积缩小，部分核碎裂；氧化损伤+五味子乙素组多数晶状体上皮细胞形态改变轻微，染色质凝聚或成块，可看到连续的核膜结构（图2）。

表1 各组SD大鼠晶状体离体培养不同时间后透明度分级比较（眼只数）

图1 各组SD大鼠晶状体离体培养24 h后透明度比较。以在白色背景下黑色十字交叉线条评价透明度，1A.空白对照组，1B.五味子乙素组，晶状体透明；1C.氧化损伤组，十字线增粗、模糊，仅晶状体中央部隐约可见线条轮廓；1D.氧化损伤+五味子乙素组，晶状体混浊情况明显轻于氧化损伤组

图2 各组SD大鼠晶状体离体培养24 h后晶状体组织透射电镜像（×500）。2A.空白对照组，晶状体上皮细胞胞膜完整连续，核仁形态规则，呈圆形或椭圆形；2B.五味子乙素组，晶状体上皮细胞形态及结构没有明显改变；2C.氧化损伤组，晶状体上皮细胞呈弥漫性改变，胞膜残缺不全，胞质内线粒体空泡变性，内质网扩张、裂解，细胞核体积缩小，部分核碎裂；2D.氧化损伤+五味子乙素组，多数晶状体上皮细胞形态改变轻微，染色质凝聚或成块，可看到连续的核膜结构

2.3 晶状体上皮细胞内HO-1及Nrf-2表达

氧化损伤组大鼠晶状体上皮细胞中HO-1及Nrf-2的蛋白表达量明显低于空白对照组及五味子乙素组（P＜0.05）；氧化损伤+五味子乙素组大鼠晶状体中HO-1及Nrf-2的蛋白表达量较空白对照组及五味子乙素组降低（P＞0.05），但高于氧化损伤组（P＜0.05）（表2）。可见，五味子乙素能使受氧化损伤晶状体上皮细胞的抗氧化酶HO-1及Nrf-2的蛋白表达增加，提示五味子乙素对H2O2引起的晶状体氧化损伤有一定的保护作用。胞自身抗氧化防御系统、延缓白内障的发生是一个合理的防治策略[7-8]。

五味子乙素是一种从五味子果实中提取的有效单体，有很强的抗氧化作用，能维持线粒体结构和功能的完整，减少活性氧生成，增强细胞的抗氧化能力，在临床上广泛用于心脑血管病的治疗[9-10]。近年来，已有学者将五味子乙素引入到眼科疾病治疗中[11]。本课题旨在研究五味子乙素对大鼠晶状体上皮细胞的作用，明确五味子乙素是否能改变晶状体上皮细胞中HO-1、Nrf-2的表达，抑制氧自由基导致

图3 Western Blot法检测各组SD大鼠离体培养晶状体上皮细胞内HO-1及Nrf-2蛋白表达的电泳图 HO-1:血红素加氧酶-1 Nrf-2:核转录因子红系2相关因子2 GAPDH:甘油醛-3-磷酸脱氢酶

表2 各组SD大鼠离体培养晶状体上皮细胞内HO-1及Nrf-2 蛋白相对表达量比较（）

表2 各组SD大鼠离体培养晶状体上皮细胞内HO-1及Nrf-2 蛋白相对表达量比较（）

注：HO-1及Nrf-2测定以GAPDH为内参。单因素方差分析，两两比较采用LSD法。与空白对照组比较，aP＜0.05；与五味子乙素组比较，bP＜0.05；与氧化损伤组比较，cP＜0.05 HO-1:血红素加氧酶-1 Nrf-2:核转录因子红系2相关因子2 GAPDH:甘油醛-3-磷酸脱氢酶

0.99±0.07 1.08±0.09 0.42±0.11ab 0.82±0.18c F值P值组别 样本量 HO-1 Nrf-2空白对照组五味子乙素组氧化损伤组氧化损伤+五味子乙素组10 10 10 10 1.02±0.17 1.14±0.16 0.33±0.14ab 0.78±0.13c 69.87 0.013 63.76 0.006

3 讨论

多项研究证实，氧化应激是白内障发生的始动环节。通常情况下，自由基的生成与氧代谢之间处于动态平衡状态，一旦这种平衡破坏，过量产生的自由基便会引起氧化应激反应[4-5]。大量的氧代谢产物导致脂质过氧化、蛋白质或DNA氧化损伤，对细胞产生直接毒性作用[6]。

虽然手术可以治愈白内障，但是，由于医疗资源分布不均衡，很多地区缺乏必要的手术器械，一些地方医院面临手术医生短缺的问题，难以满足大量患者的医疗需求。因此，有必要开发延缓白内障发展的药物。使用抗氧化剂和某些代谢受体激动剂加强细的晶状体上皮细胞凋亡，从而进一步拓宽五味子乙素的临床应用领域。

国内外学者尝试了大量方法，模拟白内障的发生机理诱导晶状体组织凋亡，如化学药物、紫外线照射、H2O2等[12-13]。本实验中，我们参考既往学者制备过氧化氢诱导鼠白内障方法，建立大鼠白内障模型[14-15]，观查五味子乙素对晶状体上皮细胞的保护作用。观察结果显示，氧化损伤组晶状体透明度明显下降，氧化损伤+五味子乙素组的透明度好于氧化损伤组，提示五味子乙素的干预对维持晶状体的透明度有保护作用。透射电子显微镜结果显示，五味子乙素可以改善晶状体上皮细胞形态，进一步证实了药物对白内障发生的抑制作用。

本实验中，我们采用1 mmol/L H2O2作为诱发因素引起晶状体氧化损伤，H2O2可引起大量自由基的产生，导致晶状体内处于氧化应激状态，抗氧化平衡机制受到破坏，我们同时测定了HO-1以及Nrf-2的蛋白含量。HO-1是细胞内广泛分布的一种抗氧化酶，几乎分布于所有的组织和器官，Nrf-2是已知的HO-1的上游调控因子，Nrf-2在体内可被氧化应激及其他反应组分广泛激活，对机体的氧化应激损伤具有保护作用。结果显示，五味子乙素能使受氧化损伤晶状体的抗氧化酶HO-1及Nrf-2的表达增加，提示五味子乙素对H2O2引起的晶状体氧化损伤有一定的保护作用。

由此可见，五味子乙素对晶状体上皮细胞氧化损伤具有抑制化作用，其作用机制可能与上调HO-1及Nrf-2的表达有关。五味子乙素作为一种单体类药物，其细胞毒性未见文献报道，鉴于其临床应用的有效性及安全性，我们认为，五味子乙素有望成为治疗白内障的有效药物。