枸杞类胡萝卜素研究进展

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(1.宁夏农林科学院枸杞工程技术研究所,宁夏银川 750002; 2.宁夏医科大学实验动物中心,宁夏银川 750004)

枸杞属(LyciumL.)属于茄科(Solanaceae),在全球有80多种枸杞,主要分布在温带和亚热带地区。我国分布有7个种和3个变种,主产西北部和北部[1]。其中宁夏枸杞(LyciumbarbarumL.)是我国主要的栽种枸杞种,其食用和药用历史已经有很长时间,在“清肝、明目、补气”上有着广泛的应用。但是有关其有效成分的分离鉴定、疾病治疗的分子机制、临床治疗效果和安全性的研究直到最近20年才慢慢受到重视。

近年来,有关宁夏枸杞,尤其是其主要功效成分枸杞多糖和多种小分子成分在植物学、药物化学、生物学和临床医学中的研究取得了很大的进展[2-4]。在一定程度上,促进了枸杞产业蓬勃发展,创造了极为可观的经济效益。截至2015年底,我国枸杞主要产区种植面积超过19万公顷,枸杞干果年产量超过50万吨。枸杞作为西北地区特别是宁夏回族自治区重点产业之一,在促进经济社会发展等方面具有突出的驱动、支撑和引领作用。

尽管目前枸杞产业蓬勃发展,产业规模持续增长,但仍存在以下问题:第一,枸杞功能物质基础研究薄弱,功能成分的结构表征、构效关系、生物功效与药理作用机制不明确;第二,功能成分分离、提取工艺落后,缺乏规模化制备工艺及活性保持工艺;第三,枸杞产品单一,缺乏高附加值深加工产品等问题,这一现状使得枸杞加工业不仅远远落后于世界发达国家的药食两用资源加工业的发展水平,而且滞后于自身产业发展的需要,整体上处于初级发展阶段,成为制约农民增收、产业增效的瓶颈。

因此,枸杞功效成分基础研究及其分离制备技术的突破是促进产业发展的关键。目前,研究较为深入的枸杞功效成分为多糖、黄酮及类胡萝卜素等。其中,类胡萝卜素是在光合生物中发现的一类天然色素,具有抗氧化性,可以预防癌症、心血管疾病和老年黄斑病变。类胡萝卜素在植物材料中含量和组成差异较大。不同含量和组成的类胡萝卜素材料其功效活性差异较大。尽管枸杞及其类胡萝卜素具有抗氧化、保护眼部、肝脏和心血管系统等作用[5-6],但是由于组成复杂,难以理清发挥这些有益效果的主要单体和具体的分子机制,导致有关枸杞类胡萝卜保健机制研究迟迟未能取得突破,未能像番茄红素等重要天然产物标志单体化合物那样引起国际研究界的重视。本文围绕枸杞类胡萝卜素的发现和应用,就其结构分类、植物学代谢特征、功效作用和深加工产品研发进展进行简要的综述,并对其未来可能的研究与开发方向和内容进行展望。

1 枸杞类胡萝卜素的结构和分类

类胡萝卜素是具有多个共轭双键的萜类化合物,是一类重要的天然色素的总称,普遍存在于动物、高等植物、真菌、藻类中的黄色、橙红色或红色的色素之中。迄今,被发现的天然类胡萝卜素已达600多种,在人体中存在的主要有α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、叶黄素、玉米黄素、番茄红素以及β-隐黄素等[6]。根据目前枸杞类胡萝卜素研究,枸杞类胡萝卜素主要有三类组成:第一类,新黄质、隐黄质、叶黄素、玉米黄素等游离型类胡萝卜素;第二类,以玉米黄素双棕榈酸为主的类胡萝卜素酯化衍生物;第三类为类胡萝卜素糖苷化衍生物[7-10]。

Inbaraj等鉴定了枸杞子中2个游离型类胡萝卜素(玉米黄素和类胡萝卜素)和7个类胡萝卜素酯化衍生物(玉米黄素双棕榈酸酯、玉米黄素单棕榈酸酯和隐黄质棕榈酸酯)[7]。Hempel等分析结果表明,宁夏枸杞绿色未成熟果实中基本上含有的都是游离型类胡萝卜素,而成熟果实中游离型类胡萝卜素非常少,基本上都被脂肪酸酯化成类胡萝卜素酯化衍生物[11]。Mia Isabelle等从新加坡收集到的枸杞材料中检测到的类胡萝卜素主要为新黄质、紫黄质和叶黄素,玉米黄素和番茄红素含量极少[6]。米佳等分析了不同种质枸杞鲜果类胡萝卜素组成情况,结果表明,9个材料中,其类胡萝卜素含量和组成差异较大。总体而言,红果枸杞中的总类胡萝卜素含量和玉米黄素双棕榈酸酯含量显著高于黄果枸杞。七个红果枸杞样品中均没有检测到玉米黄素,黄果枸杞中有少量的玉米黄素,其中,新品系15-32和黄果品系3-13的β-隐黄质含量显著高于其它枸杞品种或品系[8]。Chung等[9-10]从中华枸杞果实甲醇提取物中分离得到了3个类胡萝卜素糖苷化衍生物,这些化合物的四萜母核上均连有二条糖链,且每条糖链至少含有3个吡喃阿拉伯糖基,因此极性显著增大。部分研究报道,宁夏枸杞的主要成分为玉米黄素(玉米黄质),这可能和HPLC样品前处理进行皂化导致其他类胡萝卜素转化成了玉米黄素有关[12]。

2 枸杞类胡萝卜素的植物代谢研究

在我国发现的枸杞七个种包括中华枸杞(LyciumchinenseMill.)、宁夏枸杞(LyciumbarbarumL.)、柱筒枸杞(LyciumcylindricumKuang& A.M.Lu)、新疆枸杞(LyciumdasystemumPojark.)、黑果枸杞(LyciumruthenicumMurray)、截萼枸杞(LyciumtruncatumY.C.Wang)、云南枸杞(LyciumyunnanenseKuang & A.M.Lu)等,三变种包括黄果枸杞(LyciumbarbarumL.var.auranticarpum K.F.Ching)、北方枸杞(LyciumchinenseMill.var.potaniniiPojark.A.M.Lu)和红枝枸杞(LyciumdasystemumPojark.var.rubricaulium A.M.Lu)。Liu Y等研究表明,在宁夏枸杞和黑果枸杞果实的发育早期,叶绿体类胡萝卜素(叶黄素、β-胡萝卜素、紫黄质等)均有积累,总量为30～50 μg/g鲜重。随着果实的发育成熟,这些类胡萝卜素逐渐发生降解。在黑果枸杞果实的发育成熟过程中,没有其他新的类胡萝卜素成分合成,原有的叶绿体类胡萝卜素逐渐减少至无。而在宁夏枸杞果实的发育成熟过程中,从变色期开始,枸杞类胡萝卜素逐渐积累(同时还有枸杞类胡萝卜素的合成前体β-隐黄质和β-胡萝卜素的少量积累),直至成熟期积累为最大值(约400 μg/g鲜重)[13]。许多不同种或变种枸杞成熟果实外观存在颜色差异,其类胡萝卜素含量和组成也具有较大的差异[8],究其原因可能是色素积累的差异性。

Liu等认为,到果实成熟期时,宁夏枸杞中发育出了橙色圆形的有色体,但是黑果枸杞中没有有色体的形成。这可能是黑果枸杞类胡萝卜素不能合成积累的主要原因。在宁夏枸杞果实发育成熟过程中,枸杞类胡萝卜素合成基因的表达量有普遍提高的趋势。表达量提高比较明显的基因有DXS2、PSY1、PDS、ZDS、CRTISO、CYC-B和CRTR-B2。这些基因都是枸杞类胡萝卜素上游的生物合成基因。其中PSY1、CYC-B和CRTR-B2是有色体特异性的类胡萝卜素生物合成基因,表明宁夏枸杞果实中明显存在一条有色体特异性的类胡萝卜素合成途径。此外,LCY-E和ZEP的低转录水平也正好解释了宁夏枸杞果实中类胡萝卜素的含量远高于其他类胡萝卜素类色素含量的原因[13]。

米佳等研究表明,成熟的宁夏枸杞主栽品种,其果实中类胡萝卜素含量介于120～400 mg/100 g,是成熟黑果枸杞、黄果枸杞果实的312倍和9.7倍[8],不同种/变种枸杞的类胡萝卜素组成差异较大,其中,黄果枸杞也富含类胡萝卜素,富含游离玉米黄素,且具有不同的品种的黄果枸杞,其类胡萝卜素总含量也存在显著差异[8,14-15]。Mia Isabelle等分析的新加坡枸杞中的类胡萝卜素成分的新黄质、紫黄质、叶黄素、玉米黄素和番茄红素含量分别为82.04、89.43、91.42、4.39、0.19 μg/g[6]。因此,除黑果枸杞、宁夏枸杞外,黄果枸杞等其它种/变种在发育过程中,其类胡萝卜素的合成途径如何,尚需进一步研究。

图1 枸杞类胡萝卜素的化学结构图(C72H116O4;CAS号:144-67-2)Fig.1 The chemical structure of Goji carotenoids(C72H116O4;CAS No.:144-67-2)

3 枸杞类胡萝卜素类成分功效作用研究

3.1 抗氧化活性

类胡萝卜素作为一种营养性抗氧化剂,在动物和人体细胞中,其抗氧化损伤机制主要是有两个,一个是猝灭单线态氧和以热的形式散失能量,二是消除自由基以阻碍或终止反应链的进行[16]。有关类胡萝卜素抗氧化作用报道较多。枸杞总类胡萝卜素含量最高,其鲜果类胡萝卜素含量分别是常见果蔬的3～242倍,宁杞1号干果的类胡萝卜素提取物总抗氧化能力和FRAP值最高,分别是其它果蔬材料类胡萝卜素提取物总抗氧化能力的7.04～86.28倍,FRAP值的2.46～23.17倍[15]。ABTS+自由基清除力、FRAP值与总类胡萝卜素含量呈极显著正相关(p<0.01,相关系数分别为0.97和0.715)[14]。可见,不同来源的枸杞类胡萝卜素活性差异较大。枸杞中主要的类胡萝卜素为玉米黄素(zeaxanthin,3,3′-二羟基-β-胡萝卜素)、β-胡萝卜素和β-隐黄质(β-cryptoxanthin)的棕榈酸酯化衍生物,而枸杞各类胡萝卜素组成抗氧化活性差异性、各化学组分及抗氧化活性构效关系有待于进一步探讨阐明。

3.2 肝保护作用

Kim等[17-18]报道中华枸杞类胡萝卜素能够显著抑制体外培养的大鼠(Rattusnorvegicus)Ito细胞摄取胸苷和合成胶原的能力,并缓解由四氯化碳引起的Kupffer细胞炎症反应和氧化应激损伤。枸杞类胡萝卜素的保护能力与水飞蓟素(silybin)相当。在胆总管结扎(bile duct ligation,BDL)制备大鼠继发性胆汁淤积性肝纤维化模型中,连续6周每日口服25 mg/kg的枸杞类胡萝卜素后,大鼠的一般性肝损伤、肝纤维化程度和肝内氧化应激压力均得到了相当程度的缓解[19]。 Xiao等利用大鼠慢性酒精性脂肪肝模型研究了枸杞类胡萝卜素作用效果,结果表明,枸杞类胡萝卜素能够通过调控MAPK通路显著改善肝脏损伤[20]。临床上,在干细胞培养基中预处理0.5 mol·L-1枸杞类胡萝卜素2 h可以显著提高人源脂肪间充质干细胞在体外抵抗氧化应激/炎症损伤的能力以及治疗急性肝衰竭细胞移植的效率,其主要分子机制是通过Raf1/MAPK通路精确调控microRNA-210的表达水平。若microRNA-210的表达过低或过高,均会影响干细胞抵抗逆境的能力和移植治疗肝病的效率[21]。

3.3 眼保健功效

眼保健功效是类胡萝卜素物质主要的功效作用之一。目前研究表明,除了结构相似的β-胡萝卜素和β-隐黄质在体内可转化为维生素A,发挥眼保健作用外[22],玉米黄素与其同分异构体叶黄素在子宫内和整个生命周期的眼部发育中起着重要作用,表现为降低年龄相关眼病发展的风险[23]。究其机理在于,除了玻璃体、角膜和巩膜外,几乎所有的人眼结构都含有叶黄素、玉米黄素和其代谢产物[24]。最高浓度的叶黄素和玉米黄素在眼睛的视网膜黄斑中，在黄斑中心凹处,叶黄素和玉米黄素的浓度比眼睛其他部位高出100倍[25]。叶黄素和玉米黄素在眼部不同部位含量的差异性表明,它们可能发挥不同的主要生理功能。目前研究的主要功能有五方面:第一,黄斑类胡萝卜素吸收40%～90%的入射蓝光(取决于浓度)从而保护视网膜免受光损伤[26-28];第二,作为抗氧化剂,保护眼部视网膜色素上皮(RPE)、晶状体、睫状体和虹膜等组织的氧化损伤[24,29];第三,抗炎作用,叶黄素通过防止氧化诱导的细胞因子和炎症相关基因的上调表达的增加和通过间接补体激活途径的限速酶D因子的减少,减缓眼部炎症[30-32];第四,细胞间通讯等作用[33-34]。枸杞具有眼保健作用,其提取物具有延迟人类视网膜上皮细胞病变的作用[35]。每日饮食补充枸杞浆果90 d可以增加血浆玉米黄素和抗氧化水平,并保护老年人黄斑中色素沉着减少和软性玻璃疣累积[36]。但有关直接应用枸杞类胡萝卜素进行眼保护功效的相关研究鲜见。

3.4 生物利用度研究

诸多研究通过叶黄素和玉米黄素视网膜组织积累,研究其生物利用度。高效液相色谱法和非侵入性评估尸体解剖组织中的叶黄素和玉米黄素积累水平研究结果均表明,叶黄素和玉米黄素积累在个体之间变化差异显著。大量证据表明,饮食、代谢和遗传影响对叶黄素和玉米黄素在血液中的运输和眼中的积累、吸收均具有影响[37]。枸杞中主要的类胡萝卜素成分为棕榈酸酯化的玉米黄素,关于其生物利用度研究报道较少。恒河猴(Macacamulatta)连续服用枸杞子提取物6周后(每日约2 mg枸杞类胡萝卜素),血浆、肝脏、肾脏、黄斑中玉米黄素的含量相较对照组均有显著上升,而大脑中的含量并未有显著变化[38]。而另一项针对人类的研究发现,当受试者服用一次(5 mg)来自宁夏枸杞的3R,3′R-枸杞类胡萝卜素后9～24 h血浆中该化合物达到峰值,说明酯化的枸杞类胡萝卜素比非酯化形式的枸杞类胡萝卜素生物利用率更高[39]。Chung等[40]研究发现,健康志愿者连续28 d服用宁夏枸杞干果后,其血浆中玉米黄素的浓度比对照组高出2.5倍。且研磨过的枸杞子与热牛奶(80 ℃)共同服用后,其玉米黄素的生物利用率要显著高于与热水(80 ℃)共同服用的方式[41]。因此,推测枸杞类胡萝卜素在生物体中发挥作用的单体可能是脱去双棕榈酸基团的玉米黄素,且受饮食的影响。但是有关其体内代谢和生物利用的具体途径及相关机制还需要进一步深入研究。

4 枸杞类胡萝卜素的分析、分离制备研究

4.1 枸杞类胡萝卜素的分析方法研究

在分析方法上,枸杞类胡萝卜素主要采用分光光度计和HPLC法。游离型类胡萝卜素及其酯化衍生物极性小,除了类胡萝卜素糖苷化衍生物外,难以用常见的C18反相柱分离,故多数研究者采用C30柱分析、分离枸杞中该类化合物,并通过HPLC-DAD-APCI/MS等手段定性或定量分析枸杞子中这类成分[8]。随着枸杞类胡萝卜素化合物的逐渐明确,采用HPLC结合标准品即达到有效的分析目的。但由于该类化合物的极性小的原因,其粗提物提取及HPLC洗脱溶剂主要是己烷、丙酮、石油醚、四氢呋喃、甲基叔丁基醚、二氯甲烷等[7-9],这些溶剂均具有不同程度的毒性。但传统方法不仅步骤繁琐,且操作过程中有机溶剂对人体的伤害较大。限制了枸杞类胡萝卜素的提取分离及其进一步的深加工利用。

米佳等[8]建立了一种枸杞玉米黄素双棕榈酸酯含量的快速判断方法。即利用枸杞颜色特征值估算其玉米黄素双棕榈酸酯含量的系数模型。首先,采用柯尼卡美能达CM-5分光测色仪进行枸杞颜色特征分析,测定时每个枸杞样品选取5个果实,以白色校正瓷砖为背景,测量枸杞表面亮度(L)、红度(a)和黄度(b),根据式(1)、(2)计算c值和h值。

式(1)

式(2)

然后,根据所得鲜果枸杞的表皮颜色值L(X1),a(X2),b(X3),c(X4),h(X5),及所建回归方程Y=-582.221+0.739X1+8.028X2-0.379X3+0.452X4+0.032X5(p=0.006,拟合值R=0.993),估算枸杞中主要化合物玉米黄素双棕榈酸酯(Y)的含量[8]。

4.2 枸杞类胡萝卜素的提取制备研究

基于枸杞类胡萝卜素总体上以极性小的脂溶性化合物为主的原因,其提取制备工艺近年来从溶剂法到超临界萃取过渡发展。周学义辅以乙醇为夹带剂,获得了从枸杞、枸杞渣粕中提取玉米黄质的超临界萃取方法[42]。牛东玲、安绍芳获得了200 g原料的枸杞脂溶性色素的超临界小量制备工艺:分离压力为5～11 MPa,分离温度为30～50 ℃。所得脂溶性成分为β-胡萝卜素、β-隐黄质和玉米黄素[43]。但枸杞富含小分子糖(主要是果糖和葡萄糖),在萃取温度达到35～45 ℃时,造成萃取后料渣黏在一起,且坚硬无比地粘在萃取釜中,无法取出,致使损坏萃取釜。生产规模越大,该现象越严重。而且,目前我国主要栽种宁夏枸杞的宁杞1号、宁杞7号等品种,主要的类胡萝卜素组分为玉米黄素双棕榈酸酯,本课题组采用降糖等工艺,先将枸杞降糖,使枸杞原料总糖含量从41%～45%降低至25%～29%,水含量从11%～12%降低至8%～10%,并保留原料和料渣中的多糖含量仍然≥1.5%。然后取10kg烘干后粉碎至100目,置于超临界萃取釜中,进行萃取,然后合并收集0.6～3 h萃取物,萃取物玉米黄素双棕榈酸酯纯度达80%以上。该技术参数适应于中试放大生产[44]。

4.3 枸杞类胡萝卜素深加工产品研发

目前85%以上的枸杞是以干果形式进行市场流通的。Ma等研究表明,制干对枸杞类胡萝卜素的稳定性具有影响,玉米黄质二棕榈酸酯在干燥过程中含量有不同程度的下降,并对生产外观有影响[45]。一方面,作为枸杞主要的功效成分之一,枸杞类胡萝卜素具有潜在的多种生理学功能和保健价值;另一方面,研究主要集中在遗传代谢途径、分析测定方法方面,在枸杞类胡萝卜素深加工方面研究和开发应用鲜见,仅在部分的枸杞籽油的保健产品中,少量含有。究其原因,作者认为,除了枸杞类胡萝卜素中的玉米黄素双棕榈酸酯的功效作用及其体内代谢途径等相关机理需要进一步发掘,枸杞类胡萝卜素的稳定性和活性保持技术、提取分离新技术及加工过程中副产物的综合利用成为其进一步深加工利用的关键。

5 展望

枸杞类胡萝卜素含量和组成较复杂,不同种/变种及品种之间含量及组成差异较大。系统地阐明不同种/变种及品种枸杞类胡萝卜素的合成机制有利于进一步发掘枸杞功能基因的有效利用;同时,除了枸杞类胡萝卜素中的玉米黄素双棕榈酸酯的功效作用及其体内代谢途径等相关机理需要进一步发掘外,加强枸杞类胡萝卜素的稳定性和活性保持技术、提取分离生产技术研究与开发、集成技术研发枸杞类胡萝卜素保健产品,并对加工过程中副产物进行综合利用,将有利于枸杞物质功效成分的深加工利用和枸杞产业的进一步可持续发展。