亨氏马尾藻醇提取物体内降血脂及抗氧化作用

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(1.广州工商学院物流系,广东广州 510000； 2.广东海洋大学食品科技学院,广东湛江 524088； 3.广东省水产品加工与安全重点实验室,广东湛江 524088； 4.广东普通高等学校水产品深加工重点实验室,广东湛江 524088; 5.泉州师范学院福建省海洋藻类活性物质制备与功能开发重点实验室,福建泉州 362000)

近年来,随着人们生活模式的改变,饮食精细、运动少、生活及工作的压力等因素导致高血脂症患者急剧上升。大量研究[1-2]表明高血脂症会导致动脉粥样硬化,从而促发高血压、冠心病、脑血栓、糖尿病等多种疾病,是心血管疾病的主要诱因。高血脂症主要表现为血浆或血清中总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白含量(LDL-C)升高和(或)甘油三酯(TG)含量增高,高密度脂蛋白含量(HDL-C)下降。目前,一些药物可以有效调节血脂代谢,降低血脂水平,但存在不同程度的毒副作用,不适合长期服用。因此,寻找无毒高效的降血脂天然成分极为必要。

研究表明很多海藻如海带、龙须菜等均有降血脂的功效[3-6]。随着对南海海洋资源的开发,资源极为丰富的马尾藻受到极大的关注。亨氏马尾藻(SargassumhenslowianumC.Agardh)作为一种生长在南海海域的大型经济褐藻,化学成分丰富且拥有多种生物活性。研究发现马尾藻中多种成分具有降血脂、抗氧化、抗菌等作用[7-10],如谌素华等[11]的研究表明亨氏马尾岩藻聚糖硫酸酯具有显著的降血脂功能。由于马尾藻中含有丰富的有效成分如多糖、多不饱和脂肪酸、多酚、甾醇、类胡萝卜素等等,不同的成分结构和活性特点不同,可能存在协同或互补作用。亨氏马尾藻除了含有多糖外,还含有丰富的其他次生产物,目前已有研究对这些次生产物进行了分离和纯化及结构表征,但对这些成分的活性尚未展开较为系统的研究。

Triton WR-1339作为一种表面活化剂,注射一定剂量后能够使小鼠血清TC、TG及LDL-C明显上升,诱发急性高血脂症,该模型具有操作简便、药效明显快速的特点,因此被广泛应用于筛选天然或者合成的降血脂药物[12-16]。

本研究利用Triton WR-1339诱导建立急性高血脂小鼠模型研究亨氏马尾藻醇提取物对动物血清及肝脏脂质水平的影响,评价其体内抗氧化作用,探讨其降血脂、抗氧化作用和动脉粥样硬化之间的关系,为亨氏马尾藻的活性成分研究和开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

亨氏马尾藻 2016年5月采自广东湛江硇洲岛,洗净风干,粉碎过60目筛,-20 ℃储藏备用;SPF级昆明雄性小鼠,48只,体重(20±2) g,南方医科大学大学动物实验中心,许可证编号:SCXK(粤)2013-0034;动物饲料 广东医学院动物实验中心;Triton WR-1339 广州小木虫生物科技有限公司;BCA蛋白测定试剂盒、总胆固醇检测试剂盒、甘油三酯检测试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇测试盒、低密度脂蛋白胆固醇测试盒、总脂酶(LPL)测试盒、超氧化物歧化酶(SOD)测试盒、丙二醛(MDA)测试盒、过氧化氢酶(CAT)测试盒、总抗氧化能力(T-AOC)测试盒 南京建成生物工程研究所。

RT-34粉碎机 荣聪精密科技有限公司;N-1000V-W旋转蒸发仪 日本EYELA公司;UV2550紫外分光光度计 日本岛津公司;Varioskan Flash全自动酶标仪、微量移液器 均为美国Themo公司;CR22G高速冷冻离心机 日本Hitachi公司;Alphal-4真空冷冻干燥机 德国Christ公司;7000全自动生化分析仪 日本日立。

1.2 实验方法

1.2.1 亨氏马尾藻粗提物的制备 亨氏马尾藻粉用95%乙醇按料液比1∶10进行室温浸泡,室温振荡提取3次,提取时间依次为12、24、48 h,减压抽滤,弃去滤渣,合并滤液,减压浓缩(浓缩温度42 ℃,浓缩压力0 MPa),-52 ℃真空冷冻干燥24 h,得到亨氏马尾藻提取物,用超纯水配制稀释至所需浓度样品,进行给药[17]。

1.2.2 动物分组及处理 基础性饲料喂养,室温(23±2) ℃,湿度40%～70%,12 h光照/黑暗交替。试验前,饲养5 d以适应环境,自由采食,饮水。随后随机[18]分成4组:分别编号为正常组,高脂模型组,亨氏马尾藻提取物低、高剂量组,每组12只。按参考文献[14-15]方法,每天晚上7点进行灌胃,亨氏马尾藻提取物低、高剂量组每天按照250、500 mg/kg分别灌胃亨氏马尾藻提取物,正常组和高脂模型组给予等体积蒸馏水,灌胃体积均为10 mL/kg,试验期间,各组小鼠自由采食,饮水。连续给药12 d,末次给药前18 h,除正常组尾静脉注射等体积生理盐水外,其余各组均以350 mg/kg的剂量尾静脉注射Triton WR-1339,禁食不禁水。末次给药1 h后,眼球取血,室温静置2 h,3000 r/min离心15 min分离血清,血清放于4 ℃保存,同时摘取肝脏用生理盐水洗净,滤干,称重,于-80 ℃保存,备用。

1.2.3 检测指标和方法

1.2.3.1 体重和肝脏指数 每隔6 d同一时间称重一次,记录小鼠体重的变化。肝脏指数按照肝脏指数=肝脏重量/体重×100进行计算。初重:连续给药的第1 d小鼠重量。

1.2.3.2 血清血脂的测定 取血清测定TC、TG、LDL-C、HDL-C。所有测定均按照相应试剂盒测试说明在全自动生化分析仪上完成。按公式AI1=(TC-HDL-C)/HDL-C和AI2=LDL-C/HDL-C计算动脉粥样硬化指数[19]。

1.2.3.3 肝组织匀浆液的制备及其蛋白的测定 称取肝脏组织,按重量(g)∶体积(mL)=1∶9的比例,加入9倍体积的生理盐水,冰水浴条件下匀浆,2500 r/min离心15 min,弃去沉淀得上清液即得到10%肝组织匀浆液,分装,-80 ℃保存备用。

肝组织匀浆蛋白含量按照BCA法蛋白测定试剂盒进行测定。

1.2.3.4 肝匀浆脂质的测定 取10%肝组织匀浆液测定TC、TG、LDL-C、HDL-C。所有测定均按照相应试剂盒测试说明在全自动生化分析仪上完成。

1.2.3.5 肝匀浆脂蛋白脂酶(LPL)的测定 按照试剂盒说明以比色法进行测定。定义每毫克组织蛋白每小时在反应系统中所产生的1 μmol的游离脂肪酸为一个酶活性单位(FFAμmol/mg prot·h)。

1.2.3.6 肝匀浆抗氧化指标的测定 抗氧化能力(T-AOC)按照试剂盒说明以比色法进行测定。按照试剂盒说明进行测定。定义为在37 ℃时,每分钟每毫克组织蛋白使反应体系的吸光度值升高,每增加0.01时,为一个总抗氧化能力单位。

过氧化氢酶(CAT)按照试剂盒说明以比色法进行测定。定义每毫克组织蛋白每秒钟分解1 μmol 的H2O的量为一个活力单位。

超氧化物歧化酶(SOD)按照试剂盒说明进行测定。定义每毫克组织蛋白SOD抑制率达到50%时所对应的酶量为一个SOD活力单位(U)。

丙二醛按照试剂盒说明以TBA法进行测定。

其中,测定中所需要的肝组织匀浆液组织蛋白含量按照1.2.3.3测定的结果。

1.3 数据处理

采用JMP10.0软件进行统计分析,采用t检验进行组间差异性分析,结果表示为平均值±标准差,p<0.05表示存在显著差异性。

2 结果与分析

2.1 小鼠体重变化及肝脏指数

在实验期间,各组别小鼠的体重均呈增长的趋势,但是各组间小鼠体重无显著性差异(表1),说明亨氏马尾藻提取物没有明显影响小鼠的正常生理代谢和生长。高脂模型与正常对照组相比,肝脏指数有显著差异性,而亨氏马尾藻提取物低剂量组和高剂量组与正常对照组相比肝脏指数均无显著差异性(表1),因此,亨氏马尾藻提取物对小鼠肝脏的正常代谢影响不显著,也表明实验小鼠能够适应此两种剂量的亨氏马尾藻提取物给药处理。

表1 不同组别小鼠试验期间体重的变化以及肝脏指数Table 1 Effect of S.henslowianum extract on body weight and liver index of mice with hyperlipidemia

2.2 亨氏马尾藻提取物对小鼠血清脂质水平和动脉粥样硬化指数的影响

与正常对照组相比,高脂模型组血清中TC、LDL-C含量均显著升高,HDL-C显著降低,TG含量虽有一定的升高,但并无显著性差异,依然可以认为Triton WR-1339诱发的小鼠急性高脂血症模型成功(表2)。与高脂模型组相比,亨氏马尾藻提取物低剂量组小鼠血清TC含量显著下降。低、高剂量组TG分别下降12.61%和7.14%,低剂量组TG接近正常水平,各组间无显著差异。低、高剂量组的HDL-C均高于模型组,但仅高剂量组有显著差异。低、高剂量组LDL-C水平明显下降,均显著低于模型组。

表2 亨氏马尾藻提取物对试验小鼠血清脂质水平的影响Table 2 Effect of S.henslowianum extract on serum lipid of mice with hyperlipidemia

医学上常用动脉粥样硬化指数AI1和AI2反应动脉硬化的严重程度。与正常对照组相比,高脂模型组的动脉粥样硬化指数AI1和AI2显著升高(表3)。亨氏马尾藻提取物低剂量和高剂量处理组中,与高脂模型组相比AI1和AI2均呈显著下降趋势,其中,AI1分别下降了27.01%和33.02%,AI2分别下降了37.18%和42.31%。因此,亨氏马尾藻提取物可能具有潜在降低动脉粥样硬化的功效。

表3 亨氏马尾藻提取物对试验小鼠动脉粥样硬化指数的影响Table 3 Effect of S.henslowianum extract on atherosclerosis index of mice with hyperlipidemia

2.3 亨氏马尾藻提取物对小鼠肝脏脂质水平及脂蛋白脂酶活性的影响

为了进一步考查实验动物体内的脂肪代谢情况,对小鼠肝脏中的脂质水平进行了检测,结果表明(表4),各组小鼠的TC虽无明显变化,但与模型组相比,亨氏马尾藻提取物低剂量处理组的TG、LDL-C及高剂量处理组的TG含量显著下降(p<0.05),高剂量处理组的LDL-C有所下降,但并不显著,其中TG分别下降了19.53%和15.81%,LDL-C分别下降了17.39%和8.70%。

表4 亨氏马尾藻提取物对试验小鼠肝脏脂质水平以及脂蛋白脂酶活性的影响Table 4 Effect of S.henslowianum extract on hepatic lipid and LPL activity of mice with hyperlipidemia

表5 亨氏马尾藻提取物对小鼠肝脏的抗氧化作用Table 5 Effect of S.henslowianum extract on hepatic antioxidant status of mice with hyperlipidemia

LPL主要是催化TG水解,在乳糜微粒(CM)和极低密度脂蛋白(VLDL)的降解中发挥重要作用。瞿羽佳等[12]通过研究指出Triton WR-1339诱发的急性高血脂模型可能与LPL活力有关系。本研究结果显示,低剂量组和高剂量组的LPL活力均高于模型组,其中低剂量组变化尤其显著,推测亨氏马尾藻提取物的降脂活性可能与增强LPL活性有关。

2.4 亨氏马尾藻提取物对高血脂症小鼠肝脏的抗氧化作用

与正常对照组相比,高脂诱导后小鼠肝脏中的T-AOC、CAT活力显著降低,MDA含量显著上升,SOD也有一定程度的下降,但不显著,说明Triton WR-1339诱导的急性高血脂会并发体内氧化-还原系统失衡。与高脂模型组相比,低剂量组和高剂量组的T-AOC均增加,其中低剂量组可达到正常对照组水平相当;低剂量和高剂量组的CAT活力显著高于模型组,同时MDA含量也显著低于模型组,分别减少34.74%和28.82%,SOD活力高于正常组和模型组,但无显著差异性。这些指标水平显示出与剂量存一定的相关性,即低剂量组对肝脏氧化还原系统的作用优于高剂量组。

血脂含量的高低与人体健康密切相关,高血脂症是血脂代谢异常所导致,主要表现为血浆中TC、TG和LDL-C水平过高或HDL-C过低。HDL-C将其它器官中积累过多的胆固醇运送到肝脏进行分解,而LDL-C则将肝脏合成的胆固醇转运至全身其它器官和组织,LDL-C过高,将会引起胆固醇在血管壁上的沉积[20-21]。有研究报道,张氏马尾藻、鼠尾藻、羊栖菜等马尾藻提取物[22-25]具有显著的降血脂作用。其中,与高脂模型组对比,羊栖菜治疗组的高脂大鼠血清中LDL-C降低23.14%,HDL-C上升43.33%,肝脏组织匀浆LPL酶活力增强46.08%[24],海带治疗组中TG、TC分别下降46.99%、25.91%[4]。本研究结果中与高脂模型组对比,灌胃亨氏马尾藻提取物后的高脂小鼠血清LDL-C降低21.71%,HDL-C上升30.18%,TG、TC分别下降12.61%、8.19%,肝脏组织匀浆LPL酶活力增强21.82%。虽然亨氏马尾藻的降血脂效果低于羊栖菜和海带,但是和灌胃方式及提取方法的不同可能存在一定的关系。文中研究结果表明亨氏马尾藻醇提取物仍能有效缓解脂质代谢紊乱造成脂质在体内的沉积。

尽管尚未确切清楚高血脂症与脂质过氧化之间的机制,但是研究表明两者间关系密切,高血脂症引发机体体内氧化-还原系统失衡。近年来,大量的体内外实验和临床医学研究证明抗氧化剂对防治高血脂症引起的动脉粥样硬化有确切作用[2,25]。抗氧化体系可分为酶促与非酶促体系,酶类抗氧化体系主要由SOD、CAT等内源性抗氧化酶组成,非酶抗氧化剂主要为VE、天然化合物(酚类等)等。内源性抗氧化酶可以抑制脂质发生过氧化作用,从而抑制多余脂质蓄积在血管内,有效防止动脉硬化。MDA是脂质过氧化产物,能引起细胞损伤,测定其含量可以反映机体内脂质过氧化以及细胞受损程度。本研究结果表明,高血脂症模型SOD、CAT活力以及总抗氧化能力降低,可能是由于注射Triton WR-1339导致机体血脂升高并发生自氧化,产生过量自由基,破坏机体自由基产生和清除的平衡系统,引起机体氧化应激反应,从而降低酶活力。灌胃亨氏马尾藻提取物后,CAT、SOD酶活力升高,总抗氧化能力增强,同时MDA含量显著下降,有效防治高血脂引起的脂质过氧化,促进机体内系统平衡,而且低剂量组对肝脏氧化还原系统的作用优于高剂量组。

3 结论

本研究结果表明亨氏马尾藻醇提取物能够显著降低高脂血症小鼠体内TC、TG、LDL-C,而使HDL-C以及LPL活力显著增加,显著改善小鼠动脉粥样硬化指数AI1和AI2;同时,增强小鼠肝脏T-AOC和CAT活力,而使MDA水平显著降低,说明亨氏马尾藻醇提取物能有效降低高血脂水平,增强抗氧化能力,为亨氏马尾藻在降血脂和抗氧化性能方面的开发应用提供理论依据。