HPLC测定显齿蛇葡萄叶中4种黄酮类化合物的含量

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(1.贵州师范大学生命科学学院,贵州贵阳 550025; 2.贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室,贵州贵阳 550014; 3.贵州省产品质量监督检验院,贵州贵阳 550004)

显齿蛇葡萄(Ampelopsisgrossedentata(Hand-Mazz)W.T.Wang),为葡萄科蛇葡萄属的藤本植物[1],既可以药用也可以食用[2]。用显齿蛇葡萄嫩叶制成的类茶饮料藤茶具有清热解毒和利湿消肿的功效,主治咽喉肿痛、黄疸型肝炎、抗动脉粥样硬化等症[3-4]。研究表明,黄酮类化合物是显齿蛇葡萄的主要活性成分,其中二氢杨梅素具有清除自由基、抗氧化、抗血栓、抗肿瘤[5]、降低血脂和血糖水平,提高超氧化物歧化酶(SOD)活性等功效[6-8];杨梅素具有抗炎、抗氧化、抗过敏、降血糖和保肝[9-11]等功效;香橙素具有抗氧化的功效[12];杨梅苷具有降血压的功效[13]。

显齿蛇葡萄黄酮类化合物中主要是二氢杨梅素,所以目前对显齿蛇葡萄的质量监控大多以检测二氢杨梅素的含量为主,有HPLC和紫外分光光度法[14]。二氢杨梅素热稳定性差,在检测过程中不应该用加热方法提取[15],近两年已经有了HPLC测定二氢杨梅素、杨梅素和杨梅苷的相关报道,常敬芳等建立了显齿蛇葡萄茎中二氢杨梅素和杨梅素的HPLC测定方法[16],易开等建立了显齿蛇葡萄总黄酮提取物中二氢杨梅素、杨梅素和杨梅苷的HPLC测定方法[17]。但是到目前为止并没有建立同时测定四种黄酮类化合物的相关报道。

本课题组在测定了不同产地同一采收期显齿蛇葡萄叶中二氢杨梅素和杨梅素含量的基础上,进一步探索同时测定二氢杨梅素,杨梅素,香橙素,杨梅苷4种黄酮类化合物的HPLC方法,以期为显齿蛇葡萄质量标准的建立和进一步开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1材料与仪器

显齿蛇葡萄(Ampelopsisgrossedentata(Hand-Mazz)W.T.Wang) 采自2012～2015年每年4～9月12个不同产地(不同产地同一采收期编号:贵州施秉GS,贵州江口GJ,贵州贞丰GZ,贵州石阡GS,贵州佛顶山GF,重庆酉阳CY,江西大余JD,湖南郴州HC,湖南衡东HH,广东连州GL,广西恭城GG,广西平乐GP。同一产地不同采收期编号:贵州江口JK),经贵州师范大学余正文教授鉴定为葡萄科蛇葡萄属的干燥叶,样品产地及编号见表1和表2;二氢杨梅素(>98%),杨梅苷(>98%),香橙素(>98%),杨梅素(>98%) 江苏永健医药科技有限公司;甲醇、乙腈 天津科密欧化学试剂有限公司色谱纯;实验用水 为重蒸水;所用其他试剂 均为分析纯。

Ultimate 3000 高效液相自动进样色谱仪 赛默飞;紫外检测器 Dionex Corp:Hypersil ODS 25 μm(250 mm×4.6 mm,5 μm) 依利特公司;CPA225D电子天平 Sartorius Corp;KQ-300VDE型三频数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司。

1.2实验方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱:Hypersil ODS 25 μm(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相:甲醇(5∶11)-0.1%磷酸水溶液,梯度洗脱:0～10 min,20∶80;11～20 min 40∶60;21～25 min 20∶80。检测波长:325 nm;流速:1.0 mL/min;柱温:25 ℃.

1.2.2 标准品溶液的制备 取在干燥器(P2O5)中放置24 h的二氢杨梅素、杨梅苷、香橙素、杨梅素标准品适量,精密称定,置容量瓶中,加甲醇超声(功率300 W,频率45 kHz,30 min)使完全溶解,配制成标准品溶液以备制作标准曲线。标准品溶液中二氢杨梅素浓度为7956 μg/mL,杨梅苷浓度为166 μg/mL,香橙素浓度为290 μg/mL,杨梅素浓度为2936 μg/mL。

1.2.3 供试品溶液的制备 处理方法主要参照雷华平[18]、陈敏[19]和林诗瑶[20]的方法并略加改进,具体如下:将显齿蛇葡萄叶在60 ℃恒温烘干至质量恒定,粉碎过60目筛。取显齿蛇葡萄约0.5 g,精密称定,置于100 mL带塞三角瓶中,精密加入50 mL甲醇,密塞,摇匀,连续超声提取30 min,冷却至室温,补足失重,摇匀,过0.22 μm微孔有机相滤膜,滤液供HPLC分析用。

1.2.4 线性范围的考察 精密量取混合标准品储备液适量,逐级稀释,配制成不同浓度的混合标准品溶液。精密吸取上述不同浓度的混合标准品溶液10 μL,进样分析,测定峰面积。以进样浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,计算得回归方程。二氢杨梅素,杨梅苷,香橙素,杨梅素的线性回归方程分别为二氢杨梅素:Y=0.1418X-4.3039(R2=0.9996);杨梅苷:Y=0.3421X-1.4427(R2=0.9997);香橙素:Y=0.1973X+0.0187(R2=0.9994);杨梅素:Y=0.4352X-0.0054(R2=0.9999)。

1.2.5 精密度实验 精密吸取混合标准品溶液10 μL,在“1.2.1”项条件下平行测定6次,记录二氢杨梅素,杨梅苷,香橙素,杨梅素峰面积。

1.2.6 稳定性实验 精密吸取JK-10号样品供试品溶液,按“1.2.1”项下色谱条件,分别于0、2、4、6、8、12 h进样10 μL,测定二氢杨梅素,杨梅苷,香橙素,杨梅素峰面积,计算相对标准偏差。

1.2.7 重复性实验 分取JK-10号样品粉末,共取6份,各约0.5 g,精密称定,按“1.2.3”项下方法制备供试品溶液,平行操作6份,按“1.2.1”项下色谱条件,测定峰面积并计算各组分的平均质量分数。

1.2.8 加样回收率实验 取已知含量的JK-10号样品粉末9份,约0.5 g,精密称定。精密加入4种黄酮类化合物对照品,按“1.2.1”项下色谱条件测定,计算二氢杨梅素,杨梅苷,香橙素,杨梅素的加样回收率及平均回收率。

1.2.9 样品含量测定 取85批不同产地(贵州施秉、贵州江口、贵州贞丰、贵州石阡、贵州佛顶山、江西大余、湖南郴州、湖南衡东、重庆酉阳、广东连州、广西恭城、广西平乐);取24批同一产地(贵州江口)不同采收期显齿蛇葡萄样品,分别按照“1.2.3”项下方法制备供试品溶液,每批平行操作3份。分别精密吸取各供试品溶液10 μL,注入高效液相色谱仪,按“1.2.1”项下条件测定,计算二氢杨梅素,杨梅苷,香橙素,杨梅素含量。

1.3数据统计分析

实验数据分别由Excel,Origin 9.0和SPSS软件处理。

2 结果与分析

2.1 系统适应性实验 分别精密吸收混合标准品、供试品溶液各10 μL,按“1.2.1”项条件进样。在该色谱条件下,二氢杨梅素、杨梅苷、香橙素、杨梅素的保留时间分别为6.687、8.833、11.800、12.887。理论塔板数不低于3000,各成分分离成都均大于1.5;表明该方法专属性较好。色谱图结果见图1。

图1 标准品(A)和显齿蛇葡萄样品(B)的HPLC色谱图Fig.1 HPLC of standard sample(A) and Ampelopsis grossedentata sample(B)注:1:二氢杨梅素;2:杨梅苷;3:香橙素;4:杨梅素。

2.2方法学考察

2.2.1 线性范围考察结果 二氢杨梅素进样浓度在7.8～7956 μg/mL、杨梅苷进样浓度在14.2～1174.4 μg/mL、香橙素进样浓度在2.9～290 μg/mL、杨梅素进样浓度在0.7～46.5 μg/mL范围内与峰面积有良好的线性关系。

2.2.2 精密度实验结果 二氢杨梅素、杨梅苷、香橙素、杨梅素的平均峰面积分别为1114.5615、484.7409、56.5548、404.6557,其RSD分别为0.0、0.1%、0.8%、0.2%。

2.2.3 稳定性实验结果 供试品溶液中测定二氢杨梅素、杨梅苷、香橙素、杨梅素质量分数的RSD值分别为1.2%、1.1%、0.2%、0.3%。表明供试品溶液中的二氢杨梅素,杨梅苷,香橙素,杨梅素均能在12 h内保持稳定。

2.2.4 重复性实验结果 二氢杨梅素、杨梅苷、香橙素、杨梅素质量分数的RSD值分别为1.2%、1.1%、0.2%、0.3%。

2.2.5 加样回收率实验结果 该分析方法的回收率98.00%～100.12%,98.95%,RSD值为0.85%;98.75%～101.86%,100.14%,RSD值为1.07%;99.14%～101.24%,100.21%,RSD值为0.84%;98.25%～99.45%,98.81%,RSD值为0.59%。

2.3样品含量测定

结果见表1,表2。

表1 不同产地同一采收期的显齿蛇葡萄叶中4种黄酮类化合物的含量(%)Table 1 The contents of 4 flavones from Ampelopsis grossedentata leaves in the same harvest period and different habitats(%)

续表

续表

表2 贵州省江口县不同采收期的显齿蛇葡萄叶中4种黄酮类化合物的含量(%)Table 2 The contents of 4 flavones from Ampelopsis grossedentata leavesin the Jiangkou County Guizhou Province and different harvest periods(%)

续表

不同产地同一采收期的显齿蛇葡萄样品中的二氢杨梅素、杨梅苷、香橙素、杨梅素百分含量范围分别在0.3003%～34.1934%,0.0722～1.7105%,0.0033%～1.167%,0.0007%～0.3309%之间。采于贵州及重庆的显齿蛇葡萄样品中可以检测出四种黄酮类化合物的含量,但在其他省份中则未检测到香橙素和杨梅苷的含量。

不同采收期的显齿蛇葡萄样品中的二氢杨梅素、杨梅苷、香橙素、杨梅素百分含量范围分别在0.3362%～7.6490%,0.0391%～2.9616%,0.0017～0.8361%,0.0019%～0.1050%之间。可见,二氢杨梅素含量随着采收期的延长先升高再降低,杨梅苷含量随着采收期的延长而降低,香橙素和杨梅苷的含量均较低,且在不同采收期处于动态变化之中。

3 结论

二氢杨梅素、杨梅苷、香橙素、杨梅素等黄酮类化合物是显齿蛇葡萄的主要活性成分,本实验建立的HPLC测定显齿蛇葡萄中4种黄酮类化合物含量的方法,针对4种成分进行分析,专属性强、简便可靠,可以更全面地对该样品进行质量控制。可以看出,显齿蛇葡萄中香橙素和杨梅苷的产生很可能与环境作用因素有关,为初步判断显齿蛇葡萄的来源提供基本依据,为显齿蛇葡萄的化学生态学研究奠定基础。此外,不同的采收期对化合物的影响也较大,可以根据需要高含量的化合物有针对性的选择不同的采收期来进行采集样品,对于进一步开发该植物的有效功能成分提供依据。