雌二醇与重症手足口病患者细胞因子的相关性研究

俞慧菊，张慧英，付卓敏，张晓玲，宋志刚，易志刚

1. 上海交通大学医学院附属新华医院，上海 200092； 2. 上海市公共卫生临床中心病原体检测和生物安全部，上海 201508； 3. 上海师范大学第二附属中学，上海 200540； 4. 复旦大学基础医学院病原生物系，医学分子病毒学教育部/卫生部重点实验室，上海 200032

手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)是威胁5岁以下婴幼儿健康的重要传染病，一般症状较轻，但重症患者可表现为无菌性脑炎、脑膜脑炎、弛缓性麻痹和肺水肿等，甚至出现死亡[1]。近年来，手足口病在国内各地有暴发流行，成为严重威胁我国儿童健康的重要疾病。2008年，我国安徽阜阳暴发了大规模的手足口病疫情，死亡病例达128例，病死率为 2.5/10 000[2]。因此，自2008年起国家卫生部将手足口病纳入丙类传染病管理。

肠道病毒71型(enterovirus 71，EV71)是重症手足口病的主要病原体，可侵犯中枢神经系统，诱导神经源性肺水肿，但发病机制尚不清楚。在感染性疾病进程中患者出现细胞因子风暴较常见，这往往是导致病情加重和死亡的重要原因。EV71感染的疾病进程与机体免疫反应异常密切相关，重症手足口病患者血清中的细胞因子如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白细胞介素6(interleukin 6，IL-6)、IL-10 、IL-1β、IL-13水平较高，而宿主的强炎症反应是病情恶化的重要原因[3-5]。有研究表明，雌二醇对细胞因子有明显抑制作用，但针对重症手足口病患者中的细胞因子变化，其血清中的雌二醇与轻症患者相比是否存在差异，雌二醇水平与疾病严重程度是否相关，至今未见报道。为此，本研究收集了2010—2017年上海部分地区手足口病病例，采集鼻咽拭子、粪便、疱疹液和血液标本，通过分子生物学方法鉴定病原种类，利用免疫学技术检测血清雌二醇和细胞因子水平，探寻重症手足口病患者中雌二醇水平与细胞因子水平的关系，为手足口病的预防和治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 研究对象

本研究所选病例为 2010—2017年期间上海市公共卫生临床中心、上海交通大学医学院附属新华医院住院的手足口病患儿，共43例，参照《手足口病诊疗指南(2018版)》的诊断标准重新分组。12例入重症组，其中男性10例，女性2例，平均年龄(3.67±2.18岁)；31例入轻症组，其中男性15例，女性16例，平均年龄(3.2±1.52)岁。另有23例正常体检儿童列入对照组，其中男性13例，女性10例，平均年龄(2.14±1.57)岁。

1.2 研究方法

1.2.1EV71检测按Qiagen RNA Mini Kit试剂盒操作步骤，提取鼻咽拭子、粪便和疱疹液等样本RNA，纯化的核酸于 -80 ℃ 冰箱保存备用。采用TaKaRa公司One Step Realtime RT-PCR试剂盒，进行EV71核酸检测。

1.2.2雌二醇定量检测利用化学发光免疫技术对血清和血浆中的雌二醇进行定量检测，参照雅培公司ARCHITECT I2000分析系统和专用试剂。

1.2.3细胞因子检测采用Milliplex 多因子(xMAP)检测技术对人血浆或血清中的IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-17、γ干扰素(interferon γ，IFN-γ)等细胞因子进行定量测定。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 手足口病的临床特征

43份手足口病标本中，EV71核酸均阳性，重症组和轻症组的人群特征、临床特征分析详见表1。卡方检验显示，四肢皮疹和神经系统症状在重症患者中出现的频率更高，分别占 66.7%(P=0.018)和 33.3%(P=0.005)，与轻症组相比差异有统计学意义。两组之间其他人群特征和临床特征无统计学差异。

表1手足口病患儿的人群和临床特征

Tab.1DemographicandclinicalcharacteristicsofHFMDcases

重症组(n=12)轻症组(n=31)P值年龄(岁)(x±s)3.67±2.183.2±1.520.427男性(n,%)10(83.3)15(48.4)0.082女性(n,%)2(16.7)16(51.6)0.082体温(℃)(x±s)39.4±0.539.1±0.60.133皮疹部位 手(n,%)12(100)30(96.8)0.618 足(n,%)12(100)24(77.4)0.181 口(n,%)12(100)26(83.9)0.343 臀部(n,%)10(83.3)15(48.4)0.082 四肢(n,%)8(66.7)7(22.6)0.018其他症状 呼吸系统症状(n,%)2(16.7)4(12.9)0.696 神经系统症状(n,%)4(33.3)0(0)0.005

2.2 血清细胞因子变化与手足口病病情的相关性

检测手足口病患者血清细胞因子水平，结果显示，重症组血清中IFN-γ、IL-8和IL-6水平均显著高于轻症组(P<0.01)，但IL-1β、IL-4和IL-17水平差异无统计学意义(图1)。男性与女性患者之间血清IL-1β、IL-17、IFN-γ、IL-4、IL-6和IL-8这6个细胞因子水平差异无统计学意义。结果表明，血清IFN-γ、IL-8和IL-6这3个细胞因子水平与手足口病病情严重性相关，特别是重症患者的IL-8水平比轻症患者高26倍，差异有统计学意义(P<0.01)。

图1手足口病重症组与轻症组血清细胞因子水平的比较

Fig.1ComparisonofserumcytokinesbetweensevereHFMDgroupandmildHFMDgroup

2.3 血清雌二醇变化与手足口病病情的相关性

检测手足口病患者血清雌二醇水平，结果显示，重症组、轻症组、健康对照组的雌二醇水平分别为(6.12±6.08)pg/mL、(30.2±10.16)pg/mL、(20.62±7.43)pg/mL，差异有统计学意义(P<0.01)。男性和女性患者的血清雌二醇水平分别为(15.84±12.27)pg/mL、(30.33±14.26 pg/mL)，差异无统计学意义(P=0.125)。

2.4 细胞因子水平与雌二醇水平的相关性

血清IL-6和IL-8水平与雌激素水平有较高的相关性(Spearmen相关系数IL-6：r=-0.890 1，P=0.003 1；IL-8：r=-0.811 3，P=0.014 5)(表2)。IL-8和IL-6水平与血清雌二醇水平呈负相关，提示雌激素与炎症免疫反应密切相关。然而，细胞因子INF-γ、IL-17、IL-1β和IL-4水平与雌二醇水平无相关性。

表2手足口病患儿血清雌二醇水平与细胞因子水平的相关性分析

Tab.2CorrelationbetweenserumestradiolandcytokinesinHFMDpatients

细胞因子r值R2值P值IFN-γ-0.131 80.017 370.735 4IL-17-0.271 40.073 680.479 9IL-1β-0.322 10.103 80.397 9IL-4-0.084 50.007 140.828 9IL-6-0.890 10.792 20.003 1IL-8-0.811 30.658 10.014 5

3 讨论

手足口病是肠道病毒感染引起的一种儿童常见传染病，病原体主要血清型包括柯萨奇病毒A型和B型、埃可病毒、新肠道病毒71型。近年来，EV71的流行在亚太地区呈上升趋势，国内各地全年均有暴发流行，发病率为 37.01/100 000～205.06/100 000，报告病死率为 6.46/100 000～51.00/100 000。手足口病的发病率和病死率位于丙类传染病首位，已成为严重威胁我国5岁以下儿童健康的重要疾病。虽然目前国内EV71疫苗已上市，但手足口病疫情并未得到有效控制，其他肠道病原体一直在持续流行，重症和死亡病例也是目前手足口病的防治重点。

本研究发现，重症手足口病患者中血清细胞因子水平显著升高，在部分患者中甚至超过60 pg/mL，尤其是血清IFN-γ、IL-8和IL-6水平在重症与轻症患者之间有显著性差异。Wang等[3]研究发现，EV71 刺激后能增强细胞因子分泌，尤其是Th1 细胞分泌的相关因子(IFN-γ)和促炎因子(IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-13)显著升高。出现肺水肿等重症症状时，这些细胞因子会有较大升高，血液中的IL-6含量会达到峰值，甚至超过70 pg/mL[4-5]。Huang等[6]报道，外源性IL-6、IL-13和IFN-γ能诱导EV71感染小鼠产生致死性肺水肿，而肺水肿也是临床患者病情加重和病死的重要原因。因此，血清细胞因子水平与手足口病严重程度具有相关性。王艳春等[7]也报道，EV71感染者血清IL-6和IL-1β升高是危重症的重要因素之一，可作为病情严重程度的生物标记。Khong等[5]体外实验也证实，用IL-6抗体治疗能有效降低EV71感染小动物的死亡率。免疫反应在EV71感染的疾病进程中起重要作用，但更深入的机制仍不清楚。此外，本研究中重症患者血清IL-1β水平未出现显著差异，与Wang等[3]报道不符，分析原因可能与检测方法和试剂有关，也可能与宿主本身变化有关，需进一步验证。

有研究[8]发现，雌二醇等性激素具有显著免疫调节作用，可直接影响机体对微生物感染的免疫反应。本研究发现，手足口病患者中血清雌二醇水平与病情严重程度相关，还与IL-6和IL-8水平呈负相关，雌二醇水平越高，IL-6和IL-8水平越低，病情越轻。有学者[9]认为，雌激素可通过下丘脑-垂体-肾上腺轴的作用促进肾上腺皮质分泌糖皮质激素，后者通过复杂的调节机制对包括 IL-1β、TNF-α 在内的多种细胞因子产生抑制作用。例如，IL-6同时具有促炎症和抗炎症作用，在抵抗微生物感染过程中起重要作用[10-11]，而雌二醇、孕酮等雌激素能通过抑制核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)信号通路来调节机体单核-巨噬细胞中的IL-6表达。Ghazeeri等[12]研究发现，雌激素能调节人巨噬细胞中CD16的表达量，从而影响单核细胞和巨噬细胞分泌 IL-1β、IL-6和TNF-α等细胞因子。同时，雌激素对细胞因子分泌存在浓度依赖性，在高水平雌激素条件下，雌激素抑制巨噬细胞、造骨细胞和骨髓细胞等分泌IL-1β、IL-6和TNF-α等细胞因子[8,10,13]。因此，雌二醇可能通过上述途径来调节细胞因子分泌，从而造成手足口病疾病进程的差异。

国内多地区手足口病流行病学资料显示，手足口病患儿中男性比例高于女性，约为 1.5∶1。本研究显示，12例重症患儿中男女比为5∶1，而女性雌二醇水平比男性高，是否存在手足口病严重程度与雌激素水平相关的可能？但因病例数有限，差异无统计学意义，且未细分，不能得出两者有相关性的结论，故需扩大研究范围和增加病例数，以做进一步论证。

本研究发现，手足口病患者中血清雌二醇水平与细胞因子IFN-γ、IL-8和IL-6水平相关，这些指标的变化可能影响手足口病的预后。因此，将这些指标作为重症手足口病临床评估的生物标记，在急性期关注血清雌二醇、IL-8、IL-6的表达水平，可能有助于临床判断疾病严重程度和预测疾病演变情况，提早干预治疗，从而为防治重症并发症提供依据。本研究仅在临床上发现了雌二醇水平与细胞因子水平的关系，尚未能阐明雌二醇对细胞因子的调节信号通路和关键环节，因此雌二醇在手足口病疾病进程中的机制需进一步深入研究。