腓骨肌萎缩症患者基因突变研究

屈金辉,白雪,官士珍，黄海晶,王毅

（天津市天津医院检验科，天津 300211）

腓骨肌萎缩症（Charcot-Marie-Tooth，CMT）是最常见的遗传性周围神经病，具有高度临床变异性和遗传异质性。发病率在人群中为1/2 500[1]。此病可累及运动及感觉神经，故临床常表现为进行性远端肌无力和肌萎缩、感觉减退，又称为遗传性运动感觉性神经病（heriditary moter and sensory neuropathy HMSN）[2]。该病在幼儿期及青少年期最容易发病。肌无力和肌萎缩最先出现在肢体远端，这与其最先累及长的、粗的神经纤维有关，可出现不同程度足畸形，进而进展累及上肢及四肢近端，影响四肢的运动功能。我院近期收治2例疑似病例，经基因检测并结合临床症状确诊为CMTI型和CMTII型，现就这2例的基因型及临床特征做一探讨。

1 资料与方法

1.1 病例资料 患者I：男性，15岁，因双侧高弓足畸形5年余，逐渐加重1年余入院。患者于入院前5年余发现双足高弓足畸形，在我院门诊就诊，于入院前1年发现高弓足畸形明显加重，且出现行走疼痛，再次于我院门诊就诊，本次入院准备行畸形矫正术。查体：体温36.4℃，脉搏88次/min，呼吸23次/min，血压125/68 mmHg。神志清楚，查体合作。心、肺、骨盆和脊柱阴性，双足高弓足畸形，仰趾畸形，跖趾关节跖侧胼胝形成，双侧胫前及胫后肌群肌力正常，足趾活动、感觉及血运好，足背动脉搏动可触及。

患者于入院后完善各项术前检查。影像显示：双侧高弓足畸形。左右跟骨轴位显示其跟骨骨质形态完整，骨皮质连续，周围软组织内未见明显异常密度影。实验室检查：血尿常规、生化免疫常规及凝血常规均未提示异常。肌电图示：上下肢周围神经源性损害(运动感觉纤维受累，髓鞘损害为重，四肢SSR异常）。患者的父亲及祖父均具有双侧高弓足畸形，并且均存在脊柱侧弯症状。患者母亲未见异常。诊断此患者疑似腓骨肌萎缩症CMTI型，建议做CMT基因筛查。

患者II：男，24岁，以下肢为重的肢体远端肌肉萎缩和无力1年，中度感觉障碍。肌电图检查可见，神经传导速度轻度减慢，巨大运动单元电位、纤颤电位和正锐波，轴突变性。进行了CMT基因筛查。由于患者未住院进一步诊治，未做其他检查。患者II是否有家族史不清楚。

1.2 基因检测

1.2.1 标本采集及DNA提取 采集患者及其父母的外周静脉血2 mL，EDTA抗凝。使用AxyPrep血基因组试剂盒提取基因组DNA，NanoDrop2000核酸定量分析仪检测DNA浓度及纯度，放置-80℃保存备用。所有研究对象均签署知情同意书。

1.2.2 基因检测方法 采用多重连接探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA）主要检测 17号染色体短臂 1区 2带（17p12）上的大片段重复变异（包括PMP22基因），荧光信号强度介于0.7到1.33之间认定为正常，重复变异的荧光信号强度高于1.33。本试剂盒中17p12区域（针对范围）上的基因有PMP22、TEKT3、COX10、ELAC2，其中 DRC3（别名 LRRRC48）是在17p11.2区域上，而ELAC2、DRC3均在CMT1区域范围外。同时采用二代测序检测+一代验证的模式，筛选了与此疾病相关的基因包括DYNC1H1、MA RS、MFN2、MPZ、KIF1B、LITAF、GJB1 等 基 因变异，基因检测由北京康旭医学检验所有限公司完成。

2 结果

2.1 患者I家系基因检测 MLPA检测发现患者I染色体17p12区域大片段重复变异（包括PMP22基因），见图1。患者I其父染色体17p12区域大片段重复变异（包括PMP22基因），见图2。未发现患者I其母染色体17p12区域大片段重复变异（包括PMP22基因），见图3。

图1 受检者I DNA测序结果

图2 受检者I其父DNA测序结果

图3 受检者I其母DNA测序结果

2.2 患者II基因检测 MLPA检测未发现患者II染色体17p12区域大片段重复变异（包括PMP22基因），见图4。通过二代测序检测及一代测序验证发现患者II基因DYNC1H1 c.10198-4C＞A和基因MARS c.238C＞T的杂合核苷酸变异，测序图见图5。

图4 受检者II DNA测序结果

图5 受检者II DNA变异结果

3 讨论

CMT是一种常见的外周神经退行性遗传病，它的遗传方式包括常染色体显性遗传(Autosomal dominant,AD)、常染色体隐性遗传(Autosomal recessive,AR)和X连锁显性和隐性遗传 (X-linked dominant/recessive,XD/XR)。根据运动神经传导速度(Motor nerve conduction velocity,MNCV)和复合肌肉动作电位振幅可将该病分为3种类型：即脱髓鞘型、轴突型和中间型。脱髓鞘型除了神经活检示显著的髓鞘异常外，患者上、下肢MNCV低于正常值；轴突型神经活检示轴突变性，而MNCV未见异常变化或轻度减慢；中间型神经活检兼有脱髓鞘及轴索变性[3]。另外，根据遗传方式和神经病变的不同，将CMT分为：脱髓鞘型(也称CMTI)，起病较早，平均年龄为10岁；轴突型(也称CMTII)，起病较晚，平均年龄为23.9岁[4]。本例患者I 10岁发病，运动、感觉传导速度减慢，髓鞘损害严重，符合CMTI型。患者II 23岁发病，以下肢为重的肢体远端肌肉萎缩和无力，神经传导速度轻度减慢，纤颤电位和正锐波，轴突变性，符合CMTII型。

人类外周髓鞘蛋白基因22(PMP22)的1.5Mb正向串联重复突变导致过量表达使Schwann细胞增殖减少，临床上表现为CMT1A型。PMP22基因重复突变导致的CMT1A为CMTI最常见的亚型[5]。据报道，70%以上无血缘关系的CMT1家系及90%以上的散发患者多由17p11.2-12区（包含PMP22基因）的1.5Mb的正向串联重复突变所致，针对CMT1A型患者在该区域的断裂点设计特定引物进行扩增，再进行酶切获得特异性酶切片断即可诊断为基因重复异常[6-7]。

MLPA技术主要用于基因的重复和缺失检测。本研究采用MLPA的探针主要针对17号染色体短臂1区2带（17p12）上的PMP22基因变异情况而设计。采用二代测序+一代测序（Sanger测序）验证的模式，筛选了与此疾病相关的包括DYNC1H1、MARS、MFN2、MPZ、KIF1B、LITAF、GJB1 等在内的基因突变，涉及疾病包括：腓骨肌萎缩症、痉挛性截瘫、周围神经病变和先天性无痛无汗症等。涵盖了CMTI、CMTII、CMTX 和 CMT4型的主要致病基因，分别为 PMP22、KIF1B、GJB1和 GDAP1。测序发现了患者I及其父亲染色体17p12区域大片段重复变异（包括PMP22基因)，未发现受检者母亲染色体17p12区域大片段重复变异，说明患者I致病基因来源于其父亲的遗传，符合常染色体显性遗传的特点。患者I其他筛选基因未见异常突变。在患者II的基因检测中未发现PMP22基因的重复变异，非CMTI型。但发现了2个基因的碱基替换：基因DYNC1H1 c.10198-4C＞A 和基因 MARS c.238C＞T的杂合核苷酸变异，前者为剪切突变，后者为错义突变，不属于多态性变异，在人群中发现的频率极低，均可导致蛋白质功能受到影响，前者为CMT2O型的致病基因，后者为CMT2U型的致病基因，均为CMTII型的亚型，均为常染色体显性遗传方式，这种遗传方式的杂合变异可能导致发病。但患者II是否有家族史不清楚，还需通过其父母基因检测来验证。患者II的其他筛选基因亦未见异常突变。

目前CMT尚无有效的治疗手段，主要是对症和支持疗法。由于本病病程进展缓慢，及时诊断和治疗可延缓疾病的发展，提高患者的生活质量。另外，基因检测对于患者的确诊、遗传咨询及优生优育具有重要的临床价值，值得推广应用。