MMP-9抑制剂对大鼠脑出血模型脑水肿程度的影响及其对血脑屏障的作用

顾云鹤,张默峤,王宏达,方 想

(哈尔滨医科大学附属第一医院 病理科,黑龙江 哈尔滨150000)

脑出血(cerebral hemorrhage，CH)是指非外伤性脑实质内血管破裂而引起的出血，约占全部脑卒中的20%-30%，急性期病死率为3成以上，早期死亡率很高，脑出血发生的机制主要与脑血管的病变有关。脑出血后的脑水肿及血脑屏障的破坏均是脑出血并发症中较为严重的。越来越多的文献研究表明[1]，脑出血后的脑水肿、神经损伤以及血脑屏障的破坏与基质金属蛋白酶-9(MMP-9)有关。因此本研究基于以往的研究成果，探究MMP-9抑制剂对于脑出血后神经系统损伤、脑水肿以及血脑屏障破坏的影响作用，为脑出血并发症的预防研究做出一定的贡献。现采用大鼠进行模拟试验，实验报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

选取成年雄性Wistar大鼠共计70只，体重范围为250-300 g，实验用大鼠由我院动物实验中心提供。实验设置对照组、实验组、用药组，对照组共用7只大鼠，实验组及用药组各28只大鼠，实验组及用药组分别于12 h、24 h、3 d、5 d等时间点分成4个亚组，每个亚组7只大鼠，另7只大鼠作为备用补充用。

1.2 研究方法

1.2.1造模

实验组造模：取成年Wistar大鼠28只，10%水合氯醛(0.3 g/kg,Sigma-Aldrich,St.Louis，MO,USA)腹腔注射麻醉，麻醉后头部及股部备皮，酒精消毒；在操作台上切开右股部皮肤，切口10 mm，分离肌肉、神经，暴露股动脉后固定在立体定位仪上。大鼠门齿放在立体定位仪的前杆上，把两侧固定杆的螺纽旋松，将固定棒向两侧拉开，大鼠头部放在两侧固定杆之间，先将一侧固定杆固定于大鼠外耳道旁小凹处，再将另一侧固定杆固定于另一侧外耳道旁小凹处，两侧旋紧，紧固大鼠脑部，调动两侧固定棒，使左右读数相同。将大鼠头部抬起，使两侧外耳道中心与外眦的连线与放置定位仪的桌面平行。在立体定向仪的平台上垫一泡沫板(以减小平台钢板对大鼠体温的影响)。头部正中切开皮肤，长约10 mm，3%双氧水剥蚀骨膜，暴露前后囟。于前囟前0.02 mm，中线右侧旁开3.0 mm处钻一直径约1 mm 的小孔，不伤及硬脑膜及脑组织。利用立体定向仪立体定位大鼠的纹状体(前囟前0.2 mm,侧3 mm,深6 mm)，微量注射器向纹状体内注入0.5单位的VII型胶原酶(0.5U 溶于1.0 μl无菌生理盐水,Sigma-Aldrich)，注射时缓慢，约需5 min，注射完毕后不要立即拔针，继续留针10 min后缓慢退针，后骨蜡填充钻孔，生理盐水冲洗干净后缝合伤口。手术过程中从大鼠股动脉抽取300 μl动脉血进行血气分析和血常规，包括pH值、氧分压、二氧化碳分压、血糖和血红蛋白。

对照组造模：利用立体定向仪向纹状体内注入1.0 μl的生理盐水，操作方法同上。

用药组造模：按实验组方法造模后，立即腹腔注射MMP-9拮抗剂(GM6001，Millipore)25 mg/kg体重。

1.2.2数据测定

脑组织形态学观察：分别于各观察时点对大鼠麻醉后快速断头取出脑组织，于大鼠脑出血病灶行冠状位切开，于脑出血位置周围2 mm为厚度取脑组织作为标本，取10%甲醛对标本进行固定、脱水及包埋处理，处理过后的标本在 石蜡切片机下进行5 μm厚度的切片[2]，之后对切片进行脱蜡处理以及HE染色，于光学显微镜下进行切片脑组织进行观察。

神经组织损伤检测：取各组大鼠的脑组织石蜡切片，对切片进行TUNEL法染色，染色后观察切片中脑组织是否存在凋亡现象，其中判定脑组织细胞凋亡是以细胞胞浆或细胞核内出现黄色颗粒为准。随机于400倍镜下抽取5片切片观察并记录凋亡细胞数量。

脑水肿测定：采用干湿重法测量脑水肿。深度麻醉下将大鼠断头处死，快速完整的剥离出脑组织。用锋利的刀片在注射点前后2 mm冠状切割，获得4 mm厚的冠状脑片，将两侧半球的皮质和纹状体分离下来，分别称取重量作为湿重，用锡纸包好双侧的纹状体和皮质，做好标记，放入烤箱内100℃下烘烤24 h，再次称量作为干重。计算脑水肿的公式为[(湿重-干重)/湿重]×100%。

血脑屏障通透性测定：大鼠处死前2 h静脉注射依文思蓝染料(2%溶于生理盐水中，4 mL/kg)，可观察到大鼠结膜、齿龈、四肢末梢和尾部等处均呈蓝色，依文思蓝染料在体内循环2 h后，过量水合氯醛麻醉(0.5 g/kg)。灌注针从大鼠的左心室插入，避免破入到右心，并用止血钳固定好。剪破右心耳，从大鼠左心室缓慢持续的灌注250 ml生理盐水去除脑血管内残留的血液，直至从右心耳流出清亮的液体。断头杀死大鼠，快速取出出血侧脑半球组织，用生理盐水冲洗脑表面以减少血迹及杂质对吸光度值的影响。取损伤侧脑半球组织称重记录，并放入到甲酰胺(1 mL/100 mg)中37℃放置48 h。离心后取上清用分光光度计在620 nm下测量上清液的吸光度值。用倍比稀释法制作标准曲线,在标准曲线基础上将得到的吸光度值换算为依文思蓝染料的含量以评价血脑屏障的通透性。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 各组脑组织形态情况

观察得出，对照组大鼠颅脑内部结构正常，神经组织等排列整齐，细胞组织结构染色均匀，染色后胞浆颜色为淡红色，细胞核为蓝色。其中实验组大鼠大脑皮层神经纤维组织出现结构异常紊乱，排列不规则，细胞结构发生显著变化且部分神经细胞有凋亡的情况出现，细胞核存在固缩和溶解现象，细胞体积减小，胞质凝集等，实验组大鼠以上变化以造模后12 h时表现最为明显，之后随着时间延长，症状出现减轻。用药组大脑皮层神经纤维组织出现轻微的结构异常紊乱，出现较轻度的结构变化，细胞凋亡现象存在，但数目远低于实验组，细胞核仍有固缩和溶解的情况存在，但程度较实验组低，且随着造模时间的延长，用药组于造模12 h后的恢复速度也较实验组快。选取各组各时间段脑组织示例图片如图1-7所示。

1 对照组，2 实验组12 h，3 实验组24 h，4 实验组3 d，5 用药组12 h，6 用药组24 h，7 用药组3 d

2.2 各组神经组织凋亡情况

各组石蜡切片经TUNEL染色后进行观察。三组在各时段方差分析后，均具有统计学意义(F=8.920,10.271,9.736,12.992，P=0.000,0.000,0.000,0.000),对照组大鼠的石蜡切片中偶可发现凋亡细胞存在，实验组石蜡切片中的凋亡神经细胞数量在各时间段均高于对照组，实验组与对照组两两比较各时段均具有统计学意义(P<0.05)；用药组石蜡切片中的凋亡神经细胞数量在各时间段均低于实验组，用药组与实验组组间两两比较差异具有统计学意义(P<0.05)。具体情况如下表1所示。

表1 各组神经组织凋亡情况

注：*与对照组相比，P<0.05；#与实验组相比，P<0.05。

2.3 各组脑水肿情况

各组进行脑组织含水量检测。三组在各时段方差分析后，均具有统计学意义(F=9.652,8.663,7.756,10.726，P=0.000,0.000,0.000,0.000)；实验组大鼠的脑组织含水量在各时间段均高于对照组，其中以造模后12 h含水量最多，实验组与对照组组间两两比较差异均具有统计学意义(P<0.05)；用药组脑组织含水量在各时间段均低于实验组，用药组与实验组组间组间两两比较均具有统计学意义(P<0.05)，具体情况如下表2所示。

表2 各组脑水肿情况

注：*与对照组相比，P<0.05；#与实验组相比，P<0.05。

2.4 各组血脑屏障通透性情况

各组进行血脑屏障通透性检测，在大脑皮层依文思蓝浓度和基底节区依文思蓝浓度方面，三组各时段经过方差分析后，大脑皮层依文思蓝浓度方面(F=12.726,14.726,13.827,11.726，P=0.000,0.000,0.000,0.000)，基底节区依文思蓝浓度方面(F=15.262,11.223,12.736,10.928，P=0.000,0.000,0.000,0.000)，均具有统计学意义(P<0.05)。实验组大鼠大脑皮层及基底节区血脑屏障通透性在各时间段均高于对照组，其中以造模后12h大脑皮层及基底节区血脑屏障通透性最高，实验组与对照组两两比较差异具有统计学意义(P<0.05)；用药组大脑皮层及基底节区血脑屏障通透性在各时间段均低于实验组，用药组与实验组两两比较差异具有统计学意义(P<0.05)，具体情况如下表3所示。

表3 各组脑水肿情况比较

注：*与对照组相比，P<0.05；#与实验组相比，P<0.05。

3 讨论

由于目前人们生活水平的提高，血脂、血压及血糖等都呈现上升趋势，而这些恰恰都是脑出血的高危因素，因此导致脑出血发病率也在逐年上升。其中脑出血后主要危险因素就是脑水肿的出现，有文献研究表明，脑出血后的血肿可以刺激大量的MMP-9出现，MMP-9在正常人大脑中的含量极少，但是一旦出现脑出血，MMP-9的含量就会极速上升[3]。小剂量的MMP-9对脑组织、神经细胞起到一定的保护作用，可以对脑水肿的扩大起到减速的作用，但是大剂量的MMP-9则会对水肿的产生以及神经细胞和脑细胞的破坏起到加速作用，进而扩大水肿的面积[4]。因此目前对于MMP-9的抑制就成为了控制脑出血后脑水肿的新思路。在中枢神经系统中，肌营养不良蛋白聚糖(Dystroglycan,DG)在胶质细胞终突大量表达，被认为是维持血脑屏障一个重要条件[5]。血脑屏障是保护脑组织微环境及神经元免受血液中成分干扰的重要结构。血脑屏障是个动态的结构，可被多种神经系统疾病改变，如脑卒中[6]。 脑出血后，血脑屏障被破坏，血肿周围水肿在3 h至14 d内可持续增加，是脑出血后致残致死的重要病理基础[7]。越来越多的研究表明，脑出血后血脑屏障的破坏与MMP，尤其是MMP-9密切相关，但MMP-9通过何种途径破坏BBB目前尚不清楚[8]。基于上述研究进展[9]，实验者设想脑出血后，血肿周围水肿带中，细胞外基质受体DG表达如何改变，血脑屏障破坏及血肿周围水肿形成同MMP-9含量间的关系等，这些机制目前国内外尚无报道[10]。希望通过脑出血后血脑屏障破坏或脑水肿发生的机制研究，对今后脑出血治疗及预后提供新的临床思路。

本研究结果表明，实验组大鼠脑组织形态发生了显著的变化，相神经细胞排列出现紊乱，部分细胞出现了凋亡现象，且细胞核出现了固缩和溶解，而用药组在使用了MMP-9抑制剂后对以上细胞损伤情况明显减轻，结果表明MMP-9抑制剂对脑组织及神经有一定的保护作用，且用药组凋亡数目少于实验组，也证明了其保护作用。MMP-9抑制剂可以降低血脑屏障的通透性，降低脑水肿的出现，说明其对脑出血的进一步发展起到一定的抑制作用。

综上所述，MMP-9抑制剂对脑出血后大鼠的脑神经、脑组织损伤起到一定控制作用，减轻脑出血后的脑水肿发展以及血脑屏障通透性的增高，对于控制脑出血以及减轻脑出血并发症起到了较好的控制作用。由于目前研究局限于大鼠，并没有实际应用到临床，但本研究可以为MMP-9抑制剂在临床脑出血的应用方面起到一定的参考作用，我们也会继续完善我们的研究，争取早日应用于临床。