肺泡灌洗液、纤支镜刷出物及痰病原菌培养对下呼吸道感染的诊断价值

李秀文,王运铎,张毅华

(大连市中心医院 检验科,辽宁 大连116033)

下呼吸道感染的病原学诊断指标——BLAF、PSB刷出物和痰培养存在各自的方法学局限。口、咽部正常菌群和条件致病菌定植的存在，严重降低了痰培养结果的特异性和诊断价值；BLAF和PSB刷出物培养，虽然避免了非致病菌干扰，但繁琐而有创的检查方式，常不被患者接受。为寻求一种合理而有效的下呼吸道感染的诊断方法，为临床抗感染治疗提供依据，笔者对本院呼吸科292例同步采集的BLAF、PSB刷出物和痰标本培养结果进行比较，分析三者的差异和联系，并对下呼吸道常见病原菌耐药性进行回顾分析，现报道如下。

1 材料与方法

1.1标本来源2015年1月-2017年10月我院呼吸内科病房，疑似下呼吸道感染患者292例，其中男性191例，女性101例,中位年龄 52岁(18 岁-91岁)。

1.2标本采集

1.2.1BLAF 麻醉状态下，通过气管镜给药孔少量多次注入37℃注射用生理盐水，到达病变部位，并负压吸引灌洗液和分泌物，每次25-50 ml，共3-4次，总量100-250 ml。保证全程无菌操作，无菌容器收集灌洗液8-10 ml，于30分钟内送检。

1.2.2PSB刷出物 麻醉状态下，纤维支气管镜沿鼻腔、喉部、气管、支气管通路，到达病变部位，使用保护性防污染毛刷，获取标本，取出后直接点种在血/EMB双格培养基和沙保罗培养基内，30分钟内送检。

1.2.3痰标本 清晨，患者用冷开水漱口，深吸气后用力咳出呼吸道深部的痰液，直接咳到无菌痰盒里，标本量不少于1 ml，2 h内送检。

1.3试剂和方法

1.3.1试剂和仪器 郑州贝瑞特生物技术有限责任公司提供的哥伦比亚血/EMB双格培养基和沙保罗培养基。法国梅里埃公司的VITEK 2细菌鉴定、培养仪和ATB半自动微生物鉴定仪以及相应的试剂板条。赛默飞世尔科技(中国)有限公司提供的英国OXOID头孢派酮/舒巴坦和米诺环素药敏纸片。质控菌株：大肠埃希菌ATCC25922，铜绿假单胞菌ATCC27853，肺炎克雷伯菌ATCC79603，金黄色葡萄球菌ATCC29213，屎肠球菌ATCC29212。

1.3.2方法 三种标本均接种于血/EMB和沙保罗培养基分别进行细菌和真菌培养，细菌于37℃、5%CO2培养箱培养18-20小时,真菌于28℃培养箱培养5-7天，根据《全国临床检验操作规程》第3版[1]规定，肺泡灌洗液采用密集划线法进行计数培养,以菌落数≥104CFU/ml为阳性，<104CFU/ml为污染；PSB刷出物采用点接种，以培养出致病菌1+以上者为阳性；痰标本选取经涂片、革兰染色、镜检合格标本(上皮细胞<10/低倍视野，白细胞>25/低倍视野)，采用分区划线培养，以致病菌生长3+以上者为阳性。对培养阳性的病原菌进行相关的鉴定和药敏实验。药敏判断依据美国临床实验室标准化研究所(CLSI)2015版及2016,2017版的要求进行。

1.3.3下呼吸道感染的诊断 以参照血象、影像学支持，除外结核、病毒、支原体感染、恶性肿瘤等疾病，培养出致病菌并抗菌治疗有效为依据。

1.4统计学处理使用SPSS17.0统计学软件，诊断符合率比较用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义；一致性比较用Kappa检验，以Kappa值≥0.90，为一致性非常满意；Kappa值≥0.75，为比较满意。细菌及酵母样真菌的分布及耐药性特点，使用WHONET5.6软件进行统计分析。

2 结果

2.1诊断符合率受检的292例患者，确定诊断152例，排除诊断140例，阳性率为52.1%。其中37例患者为两种以上细菌感染，41例患者为细菌与真菌混合感染。三种标本培养结果与下呼吸道感染诊断的符合率见表1。

表1 三种标本培养结果与下呼吸道感染诊断的符合率(%)

a：与肺泡灌洗液比较，P<0.05

2.2培养结果的一致性BLAF具有较高的诊断符合率，故以BLAF培养为标准方法，使用KPSS17.0软件，计算292例受检患者PSB刷出物和痰培养结果的Kappa值，判断二者与BLAF培养结果的一致性，具体数值见表2。

表2 292例患者PSB刷出物及痰与BLAF培养结果一致性比较

PSB刷出物：一般细菌培养Kappa值=0.9606，真菌培养Kappa值=0.9794；痰：一般细菌培养Kappa值=0.7637，真菌培养Kappa值=0.7931。

2.3BLAF病原菌分布及耐药性特点BLAF培养的诊断符合率接近金标准，其阳性结果可直接反映下呼吸道感染的病原菌分布及耐药特点。本文152例确诊患者的BLAF标本，共培养出细菌192株，其中革兰阴性杆菌164株，包括肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌、嗜麦芽窄食单胞菌和其它少数细菌；革兰阳性球菌28株，主要为金黄色葡萄球菌和D群链球菌；共培养出真菌69株，其中酵母样真菌64株(白假丝酵母47株，热带假丝酵母13株、光滑假丝酵母7株和克柔假丝酵母2株)，丝状真菌5株。BLAF阳性的主要病原菌对常见抗菌药物的敏感率见表3(丝状真菌本院尚未开展药敏实验，故本文不做耐药性分析)。

表3 BLAF阳性病原菌对常见抗菌药物的敏感率(%)

3 讨论

临床对诊断指标的准确性要求日益增高。而接近金标准(组织学诊断)的BLAF及PSB刷出物培养，因符合下呼吸道感染精准诊断的要求，已被临床及实验室广泛认可[2，3]。但BLAF及PSB刷出物因采集困难、创伤较大、容易交叉感染、难于被患者接受等原因，未能在临床常规开展,而痰却因留取方便，安全无创。因此，准确定位不同标本培养结果在下呼吸道感染诊断中的价值，对呼吸科患者和临床医生都具有重要的意义。

表1结果显示：本院BLAF培养结果与临床诊断的符合率略高于PSB刷出物，差异无统计学意义，应该与BLAF灌洗范围较大而PSB刷出物为局部采集有关，而BLAF符合率明显高于痰，差异有显著性(P<0.05)，与文献报道基本一致[4]。本文痰培养的阳性和阴性符合率分别为74.3%和82.9，共检出假阳细菌27株和真菌26株，主要为鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌和酵母样真菌，这些应为本院呼吸科患者口、咽部的定植菌及正常菌群；而未被检出的51株细菌和34株真菌，主要为非发酵菌和酵母样真菌，可能与自然咳痰，深部感染的致病菌未被咳出有关。表2中Kappa值显示：无论一般菌还是真菌培养结果，PSB刷出物与BLAF均具有非常好的一致性(Kappa≥0.90)；而痰与BLAF也具有比较满意的一致程度(Kappa≥0.75)。作为下呼吸道感染的诊断指标，痰培养虽然劣势明显，但作为筛查指标，它的存在价值却是不能忽视的。

表3中BLAF培养结果显示：本院下呼吸道感染的主要病原菌为革兰阴性杆菌(62.8%)、酵母样真菌(26.4%)和革兰阳性球菌(10.7%)，与相关报道略有差别[4]。其中肺炎克雷伯菌中ESBL菌株占55.6 %，且包括3株CRE菌株；大肠埃希菌中ESBL菌株占87.5 %；金黄色葡萄球菌中MRSA菌株占50%；真菌中含丝状真菌5株(烟曲霉菌3株，黄曲霉菌1株，黑曲霉菌1株)。药敏结果显示：产ESBL的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌耐药性较高，较敏感的抗菌素主要为亚胺培南、美罗培南和阿米卡星，而CRE菌株几乎对所有抗菌素耐药；非发酵菌对包括碳青霉烯类多数抗菌素敏感率偏低，可能与它们复杂的耐药机制有关：如铜绿假单胞菌仅对阿米卡星较敏感，多与其生物膜形成，Ampc酶和MexAB 20prM主动外排泵系统的高水平表达有关[5]，鲍曼不动杆菌仅对阿米卡星、复方新诺明、米诺环素和替加环素表现出一定的敏感性，可能与其染色体基因突变，外膜孔蛋白改变、主动外排系统、产生灭活酶等原因有关[6]，嗜麦芽窄食单胞菌因产生金属酶，能水解碳青霉烯类及广谱β-内酰胺类抗菌素，且不被酶抑制剂抑制[7]，故虽然对左旋氧氟沙星、头孢哌酮/舒巴坦、复方新诺明和米诺环素敏感率保持100%，但可选择的抗菌素极其有限；金黄色葡萄球菌对万古霉素、利奈唑胺、奎奴普叮和复方新诺明的敏感率为100%，对利福平为90%，但对青霉素、红霉素和克林霉素的敏感率为0%，两级分化严重，可能与上述药物在临床长期广泛使用有关；D群链球菌仅对万古霉素、利奈唑胺和奎奴普叮敏感率较高，临床治疗多需要联合用药，值得庆幸的是，本文尚未发现耐万古霉素的金黄色葡萄球菌(VRSA)和肠球菌(VRE)菌株；酵母样真菌中白假丝酵母菌对五种抗真菌药物敏感率均为100%，热带和光滑假丝酵母菌株对氟康唑和伊曲康唑呈现不同程度的耐药，而克柔假丝酵母菌对氟康唑天然耐药。

综上所述：BLAF培养对下呼吸道病感染的诊断价值毋庸置疑，但痰培养的筛查价值也不可否定。由于采集方式的局限，现阶段前者还难以替代后者，理想的诊断方法应为：BLAF与痰培养有机结合、互相补足。多数患者可通过痰培养确定或排除诊断，只需对那些多种细菌生长，难以区分污染菌和病原菌，或患者症状消失但痰培养持续阳性，或多次真菌培养阳性患者，补充培养BLAF，从而快速锁定致病菌，进行精准治疗。这样，既能缩小有创检查的范围，减轻患者的痛苦，又能提高确诊率，避免过度治疗。