逍遥丸指纹图谱和掺伪检验方法的建立

姚立山 郝满霞

(郑州大学附属医院南阳中心医院中药科，南阳，473009)

在国家药品评价抽样、常规药材市场调研进行薄荷药材的抽检考察中发现，薄荷存在同科的留兰香代用或者混用的情况[1-3];逍遥丸的主要适应证是肝郁气滞及脾虚血虚的患者，其出处为宋代《太平惠民和剂局方》，方中以柴胡疏肝解郁，恢复肝脏条达、疏泄之性，当归、白芍养血柔肝濡养肝脏，增强其藏血之功；白术、茯苓健脾去湿，后天之本得以巩固，患者神疲症状减轻，《灵枢·平人绝谷篇》有云：“神者，水谷之精气也”。脾运化有权，统气血有司，脾土养肝，缓肝气横逆之胁痛；炙甘草甘以缓急，合生姜共奏有益气补中之效；薄荷少许，助泻肝郁之热[4-5]。而目前由于现代中青年工作压力较大，以及老龄化人口的日益增加，普遍存在肝郁气滞、脾虚血虚的情况，因此大众对于服用逍遥丸，疏肝健脾，养血和血的需求较大[6-8]；因此，薄荷作为逍遥丸中重要的药材之一，控制好逍遥丸的质量，预防在逍遥丸制作完成之前的基础药材存在掺伪的情况，尤其关键。薄荷和留兰香属于同科同属的植物，两者均属于唇形科植物，性状相近，因此无法在显微镜下鉴别[9]；然而两者的主要成分和主治功效却大相径庭，薄荷主要成分是薄荷脑，主要功效为疏肝行气，泻肝郁之热[10]；而留兰香的主要成分是香芹酮，主要功效为解表和中[11]。目前薄荷药材的检查项中没有香芹酮的检查项，比较不容易发现药材本身是否存在掺伪的问题，故本研究采集3个不同厂家各2个不同批次的逍遥丸进行检验，以薄荷脑和香芹酮为对照品，旨在采用指纹图谱分析逍遥丸的同时，建立其掺伪检验方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器 气相色谱仪(型号:7890 A，AGILENT安捷伦科技有限公司);全自动智能内校分析天平(型号:PTY124，福州普力斯特科学仪器有限公司)。

1.2 试剂 由中国食品药品检定研究院提供的批号为0728-200005薄荷脑；由德国Dr.Ehrenstorfer GmbH研究所提供的批号为00610的香芹酮；以及分析纯购于Fisher scientific公司。

1.3 分析样品 取3个不同厂家(A厂家:仲景宛西制药股份有限公司;批准文号:国药准字Z41021831;B厂家:九芝堂股份有限公司;批准文号:国药准字Z43020469;C厂家:兰州佛慈制药股份有限公司;批准文号:国药准字Z62020890)的逍遥丸，每个厂家各取2批不同生产批次的逍遥丸用研磨器研细,精密取2 g逍遥丸粉末。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

为进行掺伪检验方法建立，采用2种色谱方法进行检测，具体如下。

2.1.1 气相色谱与质谱联用法(GC-MS法) 采用质谱检测器，EI源，同时选用5%二苯基95%二甲基聚硅氧烷固定液(HP-5MS)毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，毛细管柱的进样口温度为200 ℃；柱温为程序升温，具体升温程序为初始温度90 ℃，以3 ℃/min升温至246 ℃，以30 ℃/min升温至280 ℃，保持5 min，最后以FID检测器温度为300 ℃，全扫描方式，m/z 20～1 000，柱流量1 mL/min，进样量1 μL，不分流。

2.2.2 气相色谱法(GC) 采用DM-5(5%二苯基95%-二甲基聚硅氧烷固定液)毛细管柱(30 m×0.53 mm×1.5 μm)，其进样口温度200 ℃，程序升温(同2.2.1)，柱流量3 mL/min，进样量1 μL，不分流。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取薄荷脑和香芹酮对照品，分别加分析纯(乙酸乙酯)制成每毫升含50 μg的对照溶液。

2.3 供试品溶液的制备 精密称取逍遥丸粉末0.5 g，加入200 mL水的挥发油测定容器中，充分摇匀，待粉末完全溶于水后加入2 mL分析纯(乙酸乙酯)，参照《中华人民共和国药典2010版一部附录XD》[12]中挥发油测定的方法使挥发油测定容器保持微沸状态2 h，取乙酸乙酯层作为供试品溶液。

2.4 专属性试验 取同一供试品溶液根据2.3制备的供试品溶液各5 μL，采用薄层层析方法(TLC)对逍遥丸进行专属性试验，分别点与同一片硅胶G薄层色谱板，展开剂的配比为19环乙烷：1乙酸乙酯，经过展开后，取出硅胶G薄层色谱板并晾干，随即将含有2%对二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液喷在色谱板上，加热100 ℃，5 min后将色谱板放置于365 nm的紫外光灯下观察，专属性试验结果显示逍遥丸的专属性良好。

2.5 线性关系考察 精密量取混合对照品溶液3、6、12、18、24 mL，分别置50 mL量瓶中，记录峰面积；以混合对照品进样量(μg)为横坐标(X，峰面积积分值为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，结果表明，薄荷和香芹酮混合对照品溶液在0.060 21～0.113 48 μg范围内线性关系良好。

2.6 中间精密度试验 精密吸取10 μL同一供试品溶液，连续进样5次，结果显示相对标注偏差RSD是0.91%，精度度良好。

2.7 供试品溶液稳定性试验 精密吸取10 μL同一供试品溶液，配置后分别放置0、2、4、8、16、24、48 h后进样检测，结果显示48 h内供试品溶液基本稳定，RSD是0.94%。

2.8 重复性试验 精密吸取10 μL同一供试品溶液，在相同色谱条件，相同分析仪上检测5次，结果显示标准偏差RSD为0.90%，重复性良好。

2.9 回收率试验 采用加样回收法，精密称取6份已知含量的同一批号样品各约0.5 g，分别精密加入20 mL混合对照品溶液，进行回收率试验测定，计算结果显示平均回收率为99.35%，RSD为0.86%。

2.10 样品测定结果

2.10.1 GC色谱图 如图1显示A厂逍遥丸供试品中未检出香芹酮，而B、C厂均检测出含有香芹酮，且C厂香芹酮PA值高于B厂。

2.10.2 逍遥丸GC-MS色谱图 根据GC-MS色谱图，采用正离子方式扫描，结果显示，薄荷脑和香芹酮的GC-MS特征离子峰分别是m/z 41、55、71、81、95和m/z 39、54、82、93、108。见图2。

表1 逍遥丸中薄荷脑和香芹酮含量测定(mg/g)

3 讨论

3.1 掺伪方法建立的必要性 市场上售卖的薄荷药材处理方式都是揉碎薄荷叶子，因此单纯从药材性状上很难和同科同属的留兰香进行显微鉴别[13]，根据薄荷和留兰香的主要成分不同，薄荷主要成分为薄荷脑，并不含有香芹酮[14]，因此本研究首先通过薄层层析法(TLC)对薄荷脑和香芹酮进行专属性试验，进行直接鉴别。当通过TLC明确薄荷脑和香芹酮的专属性后，根据《中华人民共和国药典》附录规定薄荷和留兰香属于同科同属植物，在种植的时候容易混入，因此允许的杂质最高限度是5%[15]，研究进一步采用GC法对逍遥丸中薄荷脑和香芹酮进行成分指纹图谱分析，结果显示A厂未检测出香芹酮，而B、C厂均检测出程度不等的香芹酮含量。为了进一步确证，研究采用GC-MS法进步对逍遥丸进行指纹图谱分析，在GC-MS质谱图中，与对照品色谱比较，供试品色谱图不可以出现保留时间相同的色谱峰;若出现保留时间相同的色谱峰，则其一级质谱不得与对照品的一级质谱一致[16-18]。

3.2 展开剂和显色剂的选择 在专属性试验TLC法中展开剂和显色剂的选择尤为重要，其中展开剂的选择能够更好的让目标成分更好的与周围的干扰斑点分开[19]，在本研究的前期试验中曾采用甲苯-乙酸乙酯(19∶ 1)、环己烷-乙酸乙酯(10∶ 1)、环己烷-乙酸乙酯(10∶ 2)、环己烷-乙酸乙酯(19∶ 1)为展开剂，结果选用环己烷-乙酸乙酯(19∶ 1)色谱效果最理想，香芹酮与周围干扰的斑点可以分开。

而由于薄荷和留兰香是同科同属植物，薄荷药材中与香芹酮Rf值相近的位置斑点颜色与香芹酮类似，可能会引起误判，研究前期试验中曾使用5%香草醛硫酸溶液作为显色剂[20]，置荧光下检视，未能将香芹酮斑点与周围干扰斑点明确区分开，而采用2%对二甲氨基苯甲醛作为显色剂时香芹酮斑点颜色与周围斑点颜色明显有区别。

图1 逍遥丸GC色谱图

注：1为薄荷脑；2为香芹酮

图2 逍遥丸GC-MS色谱图

3.3 毛细管柱的选择 采用气相色谱仪分析逍遥丸指纹图谱中GC法和GC-MS法中毛细管柱的选择尤其重要，其耐用性决定后续中精密度、稳定性、重复性和结果可靠性的关键因素[21-23]，在GC法中选择DM-5(5%二苯基-95%二甲基聚硅氧烷固定液)毛细管柱和在GC-MS法中选择HP-5MS(5%二苯基-95%二甲基聚硅氧烷固定液)毛细管柱，2种毛细管柱均具有良好的分离度和塔板数，表明本研究中逍遥丸指纹图谱选用的毛细管柱耐用性良好。

3.4 方法严谨性考察意义 指纹图谱中线性考察的意义在于分析样品在某一个浓度或峰高(面积)情况是否是成线性的,根据朗伯比尔定律，待测样品面积与浓度在这个线性范围内成正比，分析结果才是准确的[24]。而加样回收率包括绝对回收率和相对回收率,其中相对回收率有一种是回收试验法,另一种是加样回收试验法[25]。而本研究的目的主要是为了考察指纹图谱检测方法的严谨性,因此需要分析相对回收率，故而选用加样回收试验法,即在已知浓度样品中加入药物,并与标准曲线作比较。