蒙医瘟疫热症经典方查干汤对小鼠脾淋巴细胞增殖及白细胞介素-2和干扰素-γ分泌的影响

伊丽娜 张 屏 张 烜 昌妍希 杭凌宇 包保全

(1 内蒙古医科大学药学院，呼和浩特，010100； 2 内蒙古医科大学基础医学院，呼和浩特，010100)

查干汤又名四味土木香散，为蒙医治疗瘟疫热病的经典方和基础方，由土木香、苦参、悬钩子木和山柰四味药材粗粉，按比例(4∶ 4∶ 2∶ 1)混合制成，1977年作为首批民族用药载入《中华人民共和国药典》[1]，具有清瘟解表、使“未成熟热成熟”之功效，用于瘟病初期，发热发冷，头痛咳嗽，咽喉肿痛，胸胁作痛等症[2]，经辨证加味可形成60多方，用于不同瘟疫热症的治疗，在蒙医药中具有重要的地位和作用[3-5]。方中土木香、苦参和悬钩子木同为“促热疾成型类”蒙药，山柰为“祛巴达干类”蒙药[6-7]。前期研究表明，该方不同极性提取物，具有一定程度的镇痛、抗菌、抗炎作用[8-9]，并从悬钩子木中分离得到抗炎、抗氧化活性物质[10-11]。我们以小鼠脾淋巴细胞生长率、细胞因子白细胞介素-2和干扰素-γ为指标，考察该方对免疫功能的影响，并用拆方、提取不同极性部位以及测定主要化学成分等方法，探寻该方中免疫增强活性成分，为揭示该方治疗瘟疫热症的药效物质基础提供新的思路与方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 清洁级BALB/c纯系小鼠，雌雄兼用，6～8周龄，体重20～22 g，购于内蒙古医科大学实验动物中心。饲养于室温25 ℃，SPF级环境。

1.1.2 药物 土木香(20140101)、苦参(20140101)购于济南人和中药饮片有限公司，山柰(1510179)购于河北省福君堂药业有限公司。上述药材经检验，均符合2015年版《中华人民共和国药典》标准。悬钩子木药材2015年10月野生采集自内蒙古赤峰市巴林右旗，取其茎枝阴干。原植物经内蒙古医科大学药学院包保全教授鉴定，为蔷薇科悬钩子属植物库页悬钩子RubussachalinensisLeveille.，模式标本存放于内蒙古医科大学药学院标本室。

土木香内酯(LPT2014005)、异土木香内酯(LPT2014011)、对甲氧基桂皮酸乙酯(110835-201603)、苦参碱(110805-200508)和氧化苦参碱(110780-200506)对照品(中国药品生物制品检定所)；肉桂酸乙酯(MAYA-CR5019)对照品(浙江玛雅试剂有限公司)。

1.1.3 试剂与仪器 刀豆蛋白(ConA)(美国Sigma公司)；RPMI 1640培养基、胎牛血清(FBS)(美国Gibco公司)；CCK-8试剂盒(日本同仁研究院)；小鼠淋巴细胞分离液、小鼠白细胞介素-2(IL-2)酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒、小鼠干扰素-γ(IFN-γ)酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒(达科为生物技术有限公司)；HF90二氧化碳培养箱(力康生物医疗科技控股有限公司)；Multiskan GO酶标仪、SW-CJ-2FD超净工作台(美国Thermo公司)；DFC450C倒置相差显微镜(德国Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 实验组加入100 μL终浓度为25.0、50.0、100.0、200.0 μg/mL的“查干汤”及其组方药材水提物；阳性对照组加入100 μL终浓度为2.5 μg/mL的ConA，阴性对照组加入100 μL RPMI 1640培养基，置5% CO2培养箱37 ℃培养48 h，离心收集上清，-20 ℃保存。

1.2.2 给药方法 水提物的制备：查干汤及其组方药材粗粉，分别加10倍量水，回流提取3次，0.5 h/次，合并提取液，浓缩，冷冻干燥，即得。

醇提物的制备：查干汤及其组方药材粗粉，95%乙醇回流提取1次，再用75%乙醇回流提取2次，每次2 h，合并提取液，浓缩至无醇味，冷冻干燥，即得。

不同极性悬钩子木提取物的制备：悬钩子木醇提物，用10倍量水混悬，依次用等体积的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，减压回收溶剂，即得。

给药样品的配制：上述提取物和6个指标性成分称重后溶解在DMSO中，配制成200.0 mg/mL的母液，用RPMI 1640培养基稀释至不同浓度，备用。

小鼠脾淋巴细胞悬液的制备：脱颈椎处死小鼠，75%乙醇浸泡消毒，无菌条件下取出脾脏，置4～5 mL Mouse 1×淋巴细胞分离液中，轻研，200目尼龙网滤过。把悬有脾淋巴细胞的分离液立即转移至离心管中，覆盖500～1 000 μL RPMI 1640培养基，800×g离心30 min，吸取淋巴细胞层，再加入10 mL RPMI 1640培养基，颠倒洗涤，250×g离心10 min，收集细胞[12]。倾倒上清液，用含10% FBS的RPMI 1640培养基重悬细胞，台盼蓝染色计数，活细胞数大于95%，调整细胞浓度为5×106/mL，备用。

1.2.3 检测指标与方法 将脾淋巴细胞悬液加入96孔细胞培养板，每孔100 μL。实验组分别加入100 μL终浓度为0.7、3.3、16.7、50.0、100.0、200.0 μg/mL的待测药物，阳性对照组加入100 μL终浓度为2.5 μg/mL的ConA，阴性对照组加入100 μL RPMI 1640培养基，置5% CO2培养箱37 ℃培养48 h后，每孔加入20 μL CCK-8溶液，置5% CO2培养箱中37 ℃反应4 h，酶标仪检测450 nm处的吸光度(A)。

淋巴细胞生长率(%)=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%(As实验孔；Ac对照孔；Ab空白孔)。

白细胞介素-2和干扰素-γ的诱生及测定：将脾淋巴细胞悬液加入96孔细胞培养板，每孔100 μL。按照试剂盒说明，用ELISA测定细胞上清液中白细胞介素-2和干扰素-γ的水平[13-19]。

2 结果

2.1 水提物对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响 在一定浓度范围内，各样品均能不同程度提高淋巴细胞生长率。复方、苦参、悬钩子木和山柰水提物在0.7～200.0 μg/mL均能促进脾淋巴细胞增殖，且3个组方药材的促增殖作用均呈剂量依赖性；土木香在0.7～50.0 μg/mL能促进脾淋巴细胞增殖，高浓度100.0、200.0 μg/mL无促增殖作用。见表1。药物对脾淋巴细胞增殖作用强弱顺序为，山柰水提物>悬钩子木水提物>苦参水提物>复方水提物>土木香水提物(图1)。

表1 查干汤及其组方药材水提物对小鼠脾淋巴细胞生长率的影响

注：阴性对照细胞生长率为100%；与阴性对照组比较，*P<0.05

图1 查干汤及其组方药材水提物对小鼠 脾淋巴细胞增殖的影响

注：A查干汤水提物；B土木香水提物；C苦参水提物；D悬钩子木水提物；E山柰水提物

2.2 醇提物及组方药材中主要化学成分对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响 复方及其各组方药材醇提物，土木香指标性成分土木香内酯和异土木香内酯，山柰指标性成分肉桂酸乙酯和对甲氧基桂皮酸乙酯，苦参指标性成分苦参碱和氧化苦参碱，悬钩子木石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇层粗提物，在0.7～200.0 μg/mL药物浓度均无促进脾淋巴细胞增殖作用，各剂量组与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 水提物对小鼠脾淋巴细胞诱生白细胞介素-2和干扰素-γ的影响 复方及其组方药材水提物均能促进脾淋巴细胞分泌白细胞介素-2，复方、苦参和悬钩子木水提物在50.0～200.0 μg/mL均能促进脾淋巴细胞分泌白细胞介素-2；土木香水提物在25.0～100.0 μg/mL能促进脾淋巴细胞分泌白细胞介素-2；山柰水提物在25.0～200.0 μg/mL均能促进脾淋巴细胞分泌白细胞介素-2。见表2。药物对小鼠脾淋巴细胞分泌白细胞介素-2的影响强弱顺序为，山柰水提物>苦参水提物>复方水提物>悬钩子木水提物>土木香水提物。见图2。

复方及其组方药材苦参、悬钩子木和山柰水提物在25.0～200.0 μg/mL均能促进脾淋巴细胞分泌干扰素-γ；土木香水提物对脾淋巴细胞分泌干扰素-γ水平无明显影响。见表2。药物对小鼠脾淋巴细胞分泌干扰素-γ的影响强弱顺序为，山柰水提物>苦参水提物>复方水提物>悬钩子木水提物>土木香水提物。见图3。

表2 查干汤水提物对小鼠脾淋巴细胞诱生白细胞介素-2和干扰素-γ的影响

注：与阴性对照组比较，*P<0.05

3 讨论

该实验在复方、组方药材、提取物和指标性成分层面上，研究了查干汤及其组方药材对免疫功能的影响。结果，复方及其组方药材的水提物均能促进脾淋巴细胞增殖，并通过分泌白细胞介素-2和干扰素-γ发挥免疫调节作用，但其醇提物、指标性成分以及悬钩子木不同极性部位均无作用。结果表明，该方发挥免疫调节功能的药效物质基础为其中水溶性成分，应进一步对该方的水提物进行系统的化学成分和作用机制研究。同时，本研究为该方的传统剂型“水煎剂”提供了实验依据，为现代剂型开发奠定基础。

图2 查干汤及其组方药材水提物对小鼠脾淋巴细胞诱生白细胞介素-2的影响

注：A查干汤水提物；B土木香水提物；C苦参水提物；D悬钩子木水提物；E山柰水提物

图3 查干汤及其组方药材水提物对小鼠脾淋巴细胞诱生干扰素-γ的影响

注：A查干汤水提物；B土木香水提物；C苦参水提物；D悬钩子木水提物；E山柰水提物

查干汤为瘟疫热症基础方，方中土木香、苦参和悬钩子木为“促热疾成型类”蒙药，山柰为“祛巴达干类”蒙药。实验表明，两类蒙药及其复方均能促进脾淋巴细胞增殖，具有一定的免疫增强作用，在一定程度上阐释了治疗瘟疫热症用蒙药的功效主治与药效学之间的联系，为该类蒙药的药效物质基础研究提供新的思路与方法。