芫花中抗肿瘤活性成分瑞香烷型二萜的含量测定研究

陈少茹 张诚光 陈雪婷,2 詹利之

(1 广东省第二中医院/广东省中医药工程技术研究院,广州,510095; 2 广东省中医药研究开发重点实验室,广州,510095; 3 广州中医药大学热带医学研究所,广州,510405)

芫花(DaphnegenkwaSieb.etZucc)为瑞香科(Thymelaeaceae)瑞香属(DaphneL.)植物,又名杜芫,老鼠花,棉花条,头痛花,药鱼草(河北),黄阳花(陕西),野丁香花(山东),山麻皮(浙江)[1]。芫花功能与主治为泻水逐饮,解毒杀虫,用于水肿胀满,胸腹积水,痰饮积聚,气逆喘咳,二便不利,外治疥癣秃疮,冻疮[2-3],富含二萜类化合物,主要为瑞香烷型二萜,同时富含黄酮及双黄酮类化合物,还有香豆素类、木脂素类,绿原酸类等多种化学成分。芫花的主要活性成分具有利尿泻下和抗生育作用[4-5],其中抗肿瘤作用为目前研究芫花的热点,而瑞香烷型二萜正是发挥其抗肿瘤作用的主要物质基础[6-8]。现在关于瑞香烷型二萜的报道,多集中于分离和抗肿瘤活性研究,在质量控制方面的研究较为薄弱,缺乏系统评价质量的成分研究。

本实验对芫花中主要的活性成分瑞香烷型二萜:yuanhuadine(1),yuanhuafine(2),genkwadaphnine(3)，yuanhuacine(2),yuanhuahine(5),yuanhualine(6),isoyuanhuadine(7)进行含量测定研究,建立有效的HPLC方法,同时测定7个具有抗肿瘤活性的二萜,并对采摘自6个不同地区的芫花中的7个二萜进行含量测定分析,为以后芫花中瑞香烷型二萜的质量控制提供参考依据。分子式见图1。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Gilent 1200型高效液相色谱仪(四元泵、ALS、TCC、VWD和Chemstation工作站),色谱柱:ZorbaxEelipse SB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),SartoiuSCP-225D型电子分析天平(Sartoius有限公司),BUCHI旋转蒸发仪(瑞士),金利牌超生波清洗器(浙江象山县石浦海天电子仪器厂),ALC-1100型电子分析天平(北京Sartoius科学仪器有限公司)。

图1 芫花中7个瑞香烷型二萜

1.2 试剂 Yuanhuacine(2)对照品,批号ASD-00032031,纯度95.7%,购自上海迈瑞尔化学技术有限公司,yuanhuadine(1),genkwadaphnine(3),yuanhuacine(4),yuanhuahine(5),yuanhualine(6),isoyuanhuadine(7),对照品(1,3-7)为实验室通过对芫花分离得到,其纯度分别为94.2%(1),98.1%(3),92.9%(4),94.1%(5),93.7%(6),93.9%(7),无水乙醇、磷酸均为分析纯,甲醇、乙腈为色谱纯(山东禹王实业有限公司禹城化工厂)。

1.3 分析样品 采集6批芫花药材(河北、山西、陕西、甘肃、山东、江苏),经广州中医药大学中药学院中药鉴定教研室李小翠副教授鉴定为瑞香科瑞香属芫花Daphnegenkwa。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:ZorbaxEelipse SB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相:乙睛-0.1%冰醋酸水,检测波长230 nm,进样量10 μL,流速0.8 mL/min,柱温40 ℃,采用二元梯度洗脱系统,溶剂A(乙睛),B(水、0.1%冰醋酸)梯度洗脱。见表1。

表1 流动相梯度

2.2 对照品溶液的制备 将对照品加适量甲醇溶解,并稀释成浓度为0.632 1,5.022,12,33,24.66,80.1 mg/mL,混合放置于4 ℃冰箱冷藏保存备用。参照物的选择:Yuanhuacine(2)为芫花的主要有效成分之一,且Yuanhuacine(2)与其他成分的色谱峰分离度较好,因此选择Yuanhuacine(2)为参照物。

2.3 供试品溶液的制备 将粉碎的芫花过四号筛混匀,精密称取芫花粉末0.25 g,放置于带塞的锥形瓶中,精密加入75%乙醇30 mL并称定重量,超声处理60 min后再称定重量,用75%乙醇补足减失的重量,滤过并取续滤液约6 mL,过C18固相萃取小柱,弃去约2 mL滤液,其余滤液用0.45 μm的滤膜滤过即得。

2.4 提取溶剂的筛选 提取溶剂的选择:采用超声提取法,分别用水、90%乙醇、75%乙醇、50%乙醇和同样浓度的甲醇进行提取,结果75%甲醇和75%乙醇在上述色谱条件下,进样检测并记录色谱图,所含峰数较多,分离度良好,而且75%甲醇和75%乙醇提取的效率无明显差异,考虑到甲醇具有毒性,因此选用75%乙醇作为芫花的提取溶剂。

2.5 线性关系考察 取“2.4”项下各对照品储备液适量,以甲醇依次稀释成系列对照品溶液,分别吸取10 μL注入Gilent 1200型高效液相色谱仪进行检测,以各成分峰面积与对照品的进样量(μg)进行线性回归,得到各对照品的回归方程和线性范围,具体见表2。

2.6 中间精密度试验 取同一供试品溶液(河北采集样品)10 μL,连续进样5次,结果yuanhuadine(1),Yuanhuacine(2),genkwadaphnine(3),yuanhuacine(4),yuanhuahine(5),yuanhualine(6),isoyuanhuadine(7)峰面积的RSD分别为2.51%、3.84%、2.77%、2.12%、3.31%,1.35%和3.14%表明本法日内精密度良好;取同一供试品溶液连续3 d每天进样3次,结果yuanhuadine(1),Yuanhuacine(2),genkwadaphnine(3),yuanhuacine(4),yuanhuahine(5),yuanhualine(6),isoyuanhuadine(7)峰面积的RSD分别为2.65%、3.91%、4.11%、2.57%、1.78%、4.07%和2.46%,表明本法日间精密度良好。

2.7 供试品溶液稳定性试验 取供试品溶液,分别于24 h、12 h、8 h、4 h、2 h和0 h进样10 μL进行检测,yuanhuadine(1),Yuanhuacine(2),genkwadaphnine(3),yuanhuacine(4),yuanhuahine(5),yuanhualine(6),isoyuanhuadine(7)峰面积的RSD分别为3.11%、2.58%、2.19%、2.14%、2.81%、3.45%和2.11%,结果显示供试品溶液在制备后24 h内保持稳定。

2.8 重复性试验 取芫花样品(河北采集样品)5份,精密称定并按“2.4”项下方法制备供试品溶液,按“2.2”项下条件进样检测,结果测得yuanhuadine(1),Yuanhuacine(2),genkwadaphnine(3),yuanhuacine(4),yuanhuahine(5),yuanhualine(6),isoyuanhuadine(7)的平均含量分别为4.64、8.16、23.94、12.44、4.12、9.12和2.14 mg/g,RSD分别为0.5%、0.7%、0.6%、2.2%和0.5%,表明该方法重复性良好。

2.9 回收率试验 精密称取已知含量的芫花样品(河北采集样品)5份,每份0.25 g,精密加入各自对照溶液适量,按“2.4”项下方法制备供试溶液,按“2.2”项下条件进样测定并计算加样回收率,结果见表2。

2.10 样品测定结果 取6批不同产地的芫花样品,按“2.4”项下方法制备供试品溶液,精密吸取10 μL进样测定,采用外标法计算芫花样品含量,具体结果见表3,色谱图见图2。

表2 7个二萜的线性、精密度、重复性和稳定性考察(n=5)

表3 不同产地芫花中7个瑞香烷型二萜的含量差异

图2 中药芫花瑞香烷型二萜的HPLC图谱

注：1 yuanhuadine(1),2 Yuanhuacine(2),3 genkwadaphnine(3),4 yuanhuacine(4),5 yuanhuahine(5),6 yuanhualine(6),7 isoyuanhuadine(7)

3 讨论

本人在做全波长扫描,考察不同吸收波长的图谱时,重点考察了210 μm、230 μm、254 μm、280 μm和360 μm处的图谱特征。在230 μm处各成分具有较好的紫外吸收,基线平稳,分离度较好。因此,选择230 μm为芫花中抗肿瘤成分瑞香烷型二萜的检测波长。有研究显示挥发性成分多存在于职务的根、茎、叶中,多数为萜类、芳香族类,其中萜类及其衍生物含有浓度较高的挥发油,查阅大量文献[9-13]我们发现目前关于萜类及其衍生物的提取方法多样,有蒸馏法、超声提纯法、醇提法等,在流动相的选择方面,本人分别选了甲醇-水、甲醇-冰醋酸水作为流动相进行检测,结果发现分离效果不理想,在采用乙睛-水进行检测时,分离效果进一步提高,再尝试加入冰醋酸改善分离效果,结果发现有更好的分离效果,故选择乙睛-0.1%冰醋酸水作为检测芫花的流动相。

从测定结果来看,7个瑞香烷型二萜的含量均很大,而且文献报道这7个测试化合物均具有较好的抗肿瘤活性,说明我们测定的7个化合物具备较强的代表性;从6个不同产地的芫花药材测定结果来看,7个二萜均可以被检测到,且化合物genkwadaphnine(3)在6个产地的含量均较高,可以为以后深入研究芫花的质量控制提供参考依据;从总含量上看,来自甘肃的芫花药材中7个瑞香烷型二萜含量明显高于其他产地,提示二萜的含量可能和地域有关,并且我们还可以看到在地处平原气候的地区如:河北、山西、陕西、山东产地的药材中瑞香烷型二萜含量较接近,而处于较为南部的江苏省产地的芫花中瑞香烷型二萜则较少,结合文献报道的相关依据,我们可以推测作为次级代谢产物的瑞香烷型二萜的含量是和产地、环境因素有关的[14-16]。

本文通过色谱条件的探索研究,建立了简单、有效的测定芫花中抗肿瘤活性成分瑞香烷二萜的方法,能够检测出芫花中抗肿瘤活性成分瑞香烷型二萜较高的含量,为后续更好的对这类二萜的质量控制提供了理论依据。