气相色谱-质谱研究加味逍遥丸中的挥发性成分

陈 波 乌日根

(内蒙古医科大学附属医院药剂部,呼和浩特,010000)

加味逍遥丸又名丹栀逍遥丸,出自《太平惠民和剂局方》,是在逍遥丸的基础上加牡丹皮、栀子二味而成。是疏肝解郁,清热调经的常用方剂,由此制成的中成药因疗效切确、使用简便从而在临床上得到广泛的使用[1]。因加味逍遥丸庞大的市场基础,故生产厂家众多。由于复方的中成药制剂中,其各个药味间相互配伍,药性及药物有效化学成分的相互作用机制都较为复杂,故不同的生产企业和药品批次之间,其药物的有效成分及产品质量存在一定的差异[2-3]。故而对中成药的复方进行研究,以求明确各个药物的有效成分及相互的药理作用,对提高制备后中成药质量控制及临床疗效有重要的意义,因此这也成为近年来中药研究的热点。目前在加味逍遥丸的药物研究中,多为使用薄层色谱法、高效液相色谱法等进行药物的有效成分及含量的鉴定[4-7],而这些检测方法,常常不能对加味逍遥丸中会发性成分加以检测及定性鉴别。而在组成加味逍遥丸的多种中药均含有挥发性的药物成分,例如当归、栀子、丹参、柴胡、白术、芍药、薄荷、生姜中均含有挥发性的药物成分,而这些成分也是加味逍遥丸的有效药物组成,忽视这些挥发性药物的研究,则对成药组方的药理、药效和质量评价等方面的研究均是不够客观或较为片面的,这将不利于中成药制作工艺和质量控制体系的提升。气相色谱-质谱分析(Gas Chromatography-mass Spectrometry,GC-MS),是一种将气相色谱(Gas Chromatography,GC)[8]和质谱分析(Mass Spectrometry,MS)[9]联合应用的技术。它可直接使用GC分离样品,并使分离后的化合物通过MS进行离子化,同时具有GC的高效分离和MS的准确定量的有点,故而目前已经成为研究挥发性化合物的最为有效及普遍的方法之一。本研究使用GC-MS对加味逍遥丸中挥发性成分进行分离及鉴定,旨在更为全面、客观的了解加味逍遥丸中各种挥发性有效成分的组成和药效,提供有效的鉴定方法,以期为逍遥丸的气相色谱指纹图谱及药物质量管理提供客观依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 挥发油提取器(型号:DGT,供应商:天津市德固特科技发展有限公司);气相色谱-质谱联用仪(型号:GCMS-QP2010,供应商:日本岛津公司);气相色谱-电子捕获检测器(型号6890N;供应商:美国Agilent公司)。

1.2 试剂 正己烷和正十八烷均购于北京中科仪友化工技术研究院;实验用二次蒸馏水。

1.3 分析样品 加味逍遥丸(北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂,国药准字Z11020248)。

2 方法与结果

2.1 GC-MS色谱质谱条件 色谱条件:选择直径为0.25 μm的Rxi-5ms的色谱柱(规格:30 m×0.25 mm),柱流量为1 mL/min;以氦气(He)为载气,采用30∶ 1的分流比;进样量:0.5 μL,以260 ℃为进样口温度,升温程序:首先保持初始柱温60 ℃ 3 min,随后以10 ℃/min的升温速率升至175 ℃,再下降10倍升温速率以1 ℃/min缓慢升温至195 ℃,最后增加5倍升温速率以5 ℃/min升温至240 ℃,维持15 min后再缓慢升至250 ℃的接口温度;溶剂延迟时间为3 min。质谱条件:电子轰击离子源的轰击能量设置为70 eV,离子源温度设置为200 ℃;以0.7 KV为检测电压;采用全谱扫描,其质量扫描范围为m/z 40～550 amu,质谱数据库参照NIST库。

2.2 内标溶液的制备 采用容量瓶精密量取100 μL正十八烷作为内标物,以10 mL正己烷定容,配制出浓度为7.8 mg/mL的内标溶液。

2.3 供试品溶液的制备 精密称取18 g加味逍遥丸样品粉碎物,倒入500 mL圆底烧瓶中,为充分使加味逍遥丸样品碎裂细小化,在圆底烧瓶中加入270 mL二次蒸馏水并室温浸泡10 h;加味逍遥丸挥发性成分提取参照《中华人民共和国药典》[10]附录XD“挥发油测定法”甲法的实验规定,加热圆底烧瓶使样品溶液微微沸腾,并保持水蒸馏微沸状态11 h,采用挥发油提取器收集挥发性成分;加入适量无水硫酸钠到蒸馏所得到的挥发性成分中帮助其干燥除水,将干燥后的挥发性成分小心移取至1.5 mL样品瓶中,加入精密量取的7.8 mg/mL正十八烷内标溶液100 μL,并以正己烷定容至1.5 mL,充分混合均匀既得供试品溶液,4 ℃下密封保存待用。

2.4 正交实验设计 根据提取时间、固液比和浸泡时间这3个重要实验因素进行正交实验设计,结果显示,将提取时间9 h、固液比1∶ 15、浸泡时间10 h时是水蒸馏法提取加味逍遥丸中挥发性成分的最佳提取条件。

2.5 专属性试验 取同一供试品溶液根据2.3制备的供试品溶液各5 μL,加味逍遥丸专属性试验采用薄层层析方法(TLC)进行操作,将供试品溶液分别点于同一片硅胶G薄层色谱板,以环乙烷和乙酸乙酯作为展开剂,配比为19∶ 1;晾干后随即将40%硫酸溶液(含有2%对二甲氨基苯甲醛)喷在色谱板上,加热至100 ℃,冷却5 min后在紫外光灯(波长365 nm)下观察,专属性试验结果显示加味逍遥丸的专属性良好。

2.6 精密度试验 提取1份按照2.3项下GC-MS分析条件制备的加味逍遥丸样品溶液,连续测定6次,以内标物正十八烷的相对保留时间和相对峰面积作为参照,计算得到各主要峰的相对保留时间和相对峰面积,结果显示相对保留时间(Tr=Ti/Ts)的RSD(n=6)为0.0074%～0.24%,相对峰面积(Ar=Ai/As)的RSD(n=6)为0.41%～4.7%,均符合RSD小于5%的要求,表明气相色谱精密度良好。

2.7 稳定性试验 提取1份按照2.3项下GC-MS分析条件制备的加味逍遥丸样品溶液,分别在8个不同时间段内(0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、36 h、48 h)进行检测,以内标物正十八烷的相对保留时间和相对峰面积作为参照,计算得到各主要峰的相对保留时间和相对峰面积,结果显示相对保留时间(Tr=Ti/Ts)的RSD(n=8)为0.0065%～0.32%,相对峰面积(Ar=Ai/As)的RSD(n=8)为0.33%～4.9%,均符合RSD小于5%的要求,说明了加味逍遥丸样品溶液在48 h内稳定性良好。

2.8 重复性试验 提取6份按照2.3项下GC-MS分析条件制备的同一批次加味逍遥丸样品溶液,以内标物正十八烷的相对保留时间和相对峰面积作为参照,计算得到各主要峰的相对保留时间和相对峰面积,结果显示相对保留时间(Tr=Ti/Ts)的RSD(n=6)为0.018%～0.51%,相对峰面积(Ar=Ai/As)的RSD(n=6)为0.19%～4.8%,均符合RSD小于5%的要求,证明了GC-MS试验重复性良好。

2.9 样品测定结果

2.9.1 加味逍遥丸挥发性成分总离子流色谱图 加味逍遥丸在气相色谱-质谱研究中以正十八烷(S)为内标物,检测到53中挥发性成分。见图1。

2.9.2 加味逍遥丸挥发性成分分析 将总离子流色谱图中所检测出的色谱峰与NIST标准质谱数据库中的标准谱图进行参照比较,分析53个挥发性成分的具体化学成分信息,其中芳香族类和萜烯类挥发性成分均有11种,萜醇类挥发性成分有8中种,醛类挥发性成分有6种。见表1。

3 讨论

气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)是一种气相色谱和质谱检测联合使用的检测技术,自从1957年被开发以来,GC-MS技术已经成为目前应用最广泛的检测手段。几乎在所有的中药检测分析中,特别是如中成药等复杂的混合物检测,GC-MS已经成为主要的药品定性、定量检测最为有效的方法之一[11]。例如,陈智煌等[12]使用GC-MS法对羌活的挥发油成分进行分析,并确定其相关成分的特征指纹图谱,总结了羌活挥发油具有抗炎、镇痛作用的主要药理成分。薛子钰等[13]则使用GC-MS对不同炮制方法的当归进行观察,分析了当归挥发油的成分及对大鼠尿液代谢可能起到作用的相关机制。本研究在使用GC-MS对加味逍遥丸的挥发性成分进行研究,可较为全面的、综合的反应出不同挥发性成分间的差异。

图1 加味逍遥丸挥发性成分总离子流色谱图

注：S为内标物正十八烷

表1 加味逍遥丸挥发性成分分析

3.1 内标溶液的制备 使用正构烷烃作为内标的参照物进行GC分析。在分别使用正已烷、正十二烷、正十四烷、正十六烷、正十八烷等进行连续测样3次后,正十二烷、正十四烷的色谱峰位间相互距离较大,而正十六烷峰位与样品重叠,不利于样品挥发性的成分检测,均不作为内标参照物,故在筛选后选用正十八烷作为内标,正已烷定容,制备出对检验样品无干扰的内标溶液。

3.2 挥发性成分的提取 挥发性成分多存在于植物的花、根、叶、根茎、果实和种子中,多为萜类、芳香族类、脂肪族类和含氮含硫化合物等,其中萜类及其含氧衍生物在挥发油中具有较高的含量,芳香族化合物通常具有生物活性,是挥发油特异芳香气味的来源[14];本研究结果与上述描述一致,结果显示,总离子流色谱图中分析53个挥发性成分的具体化学成分信息,其中芳香族类和萜烯类挥发性成分均有11种。挥发性成分的提取分离技术,决定了后续质量研究的品质。目前挥发性成分的提取方法有很多,如水蒸馏法、超声提取技术等[15],在加味逍遥丸挥发性成分研究的提取中常用的水蒸馏提取法和超声技术提取法[16],其中水蒸馏法是《中华人民共和国药典》推荐的标准方法;而超声提取法是通过机械效应和热效应,平衡提取溶剂并提高挥发性成分的溶解度。有研究人员在采用水蒸馏法和超临界CO2流体萃取法提取逍遥散挥发性成分的研究中,水蒸馏法提取所得的挥发性成分较超临界CO2流体萃取法提取所得的挥发性成分复杂,因此本研究采用水蒸馏法提取加味逍遥丸中的挥发性成分。

3.3 正交实验设计 在称取18 g加味逍遥丸后,将其粉碎,碎后的颗粒放置于500 mL圆底烧瓶中,加入一定量的蒸馏水后,分别选择不同提取时间(4 h、6 h、8 h、9 h、10 h)、药品与蒸馏水的不同固液比(1∶ 5、1∶ 10、1∶ 15、1∶ 20)、不同浸泡时间(2 h、6 h、10 h、14 h、18 h)作为干预条件,观察不同条件下对相对峰面积的影响。在分别进行多次不同的平行试验后,我们可确定,在选择加味逍遥丸颗粒与蒸馏水固液比为1∶ 15、浸泡10 h,提取时间为9 h时,其相对峰面积为最大,表明其为最佳实验条件,故选择此作为正交实验条件[17-18]。

3.4 色谱柱的选择 在GC-MS分析法中,选择正确的毛细管柱,对结果的精密性、准确性、稳定性及可重复性的影响至关重要。在分别比较agilent CP-SIL5CB、CP-SIL13CB、CP-SIL24CB、HP-1、HP-5等毛细管柱后,发现HP-5(30 m×0.32 mm,0.25 μm)具有较好的分离度,柱效和所获得的色谱峰数较好。