颐脑解郁方对缺血性脑卒中及卒中后抑郁、焦虑、痴呆大鼠宏观表征变化的干预作用

赵子珺 赵瑞珍 张 媛 赵 芸 郑春翔 唐启盛

(1 北京中医药大学，北京，100029； 2 北京中医药大学第三附属医院，北京，100029)

脑卒中是导致我国居民死亡的第一大病因，其发病率呈逐年升高的趋势[1-2]。脑卒中后精神疾患的出现，直接影响患者的生命质量、躯体功能和认知功能的康复，提高脑卒中的病死率[3-5]。目前对于卒中后精神疾患的治疗，西药具有较强的不良反应，患者普遍依从性差[5]，与之相比，中医在脑卒中及卒中后精神疾患的治疗方面具有一定优势和发展潜力。异病同治是中医辨证论治的特色和精髓，唐启盛教授在既往对脑卒中后精神疾病的临床研究中发现，其中医证候多属于肾虚肝郁型，采用益肾调气中药收效显著。“有诸内必形诸外”，动物宏观表征是内在病理变化的外在体现，以宏观表征为着眼点开展研究，比较接近临床诊病过程，符合中医整体观和辨证论治的临床思路，同时也是建立中医“病证结合”模型的较好切入点[6]。因此，本研究复制缺血性脑卒中、PSD、PSA、VaD动物模型，动态观察脑卒中向PSD、PSA、VaD演变过程中不同模型、不同时点的表征变化特点。探讨各模型表征演化趋势，并进行证候评价；再以益肾调气方药颐脑解郁方对模型大鼠进行干预，同时以“药物反证”验证证候模型，观察并记录用药后大鼠体重及表征变化情况，以期评价益肾调气方药颐脑解郁方的治疗作用，并为卒中后精神疾患的病证结合研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级雄性wistar大鼠，体重(200±10)g，6周龄，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK(京)2016-0006。饲养于室温(20±2)℃、相对湿度50%～60%的环境，光照节律12 L/12 D(6：00-18：00)。预养1周后,进行Open-field行为学评分,取评分相近的大鼠,随机分为卒中模型组、卒中观察组、卒中假手术组、PSD模型组、PSD观察组、PSD假手术组、PSA模型组、PSA观察组、PSA假手术组、VaD模型组、VaD观察组、正常组，每组8只。

1.1.2 药物 颐脑解郁方(药物组成：刺五加20 g、郁金10 g、白芍10 g、栀子10 g)，由北京中医药大学第三附属医院提供。以相当于成人剂量的7倍计算，配成419 mg/kg混悬液(即1剂配方颗粒加100 mL蒸馏水)，贮存于4 ℃冰箱中备用，临用前加热。

1.1.3 试剂与仪器 戊巴比妥钠(P3761-5，Sigma)，尼龙栓线(2838-A4，北京沙东生物技术有限公司)；大鼠夹尾夹(自制)、大鼠束缚架(自制)。

1.2 方法

1.2.1 分组及模型制备 进购动物并适应性预养1周后，通过Open-filed实验评分将大鼠随机分为以下12组：卒中模型组、卒中观察组、卒中假手术组、PSD模型组、PSD观察组、PSD假手术组、PSA模型组、PSA观察组、PSA假手术组、VaD模型组、VaD观察组、正常组。

脑卒中模型：参考新式线栓法[7]，制备大脑中动脉梗死的脑卒中模型。动物禁食水12 h后，腹腔注射1%戊巴比妥钠(5 mL/kg体重)麻醉动物。颈正中线切口3 cm左右，钝性分离，暴露右侧胸锁乳突肌和胸骨舌骨肌之间的三角区域，沿胸锁乳突肌内侧分离肌肉筋膜，暴露CCA，结扎CCA近心端，距此节1 cm处的CCA远心端系一松节备用，在CCA近ICA分叉处以动脉夹暂时夹闭，在CCA的两线间，距CCA分叉处5 mm左右，剪一小口，松开动脉夹，插入经多聚赖氨酸处理的尼龙栓线，在栓线标记接近CCA与ICA分叉处或遇阻力感时停止，2 h后进行再灌注。入组标准：大鼠于缺血再灌注2 h后出现对侧前肢蜷曲、行走转圈或行走向对侧倒体征则纳入，无此体征或于2 h后仍不清醒者弃去。假手术组仅分离CCA、ICA，不插入栓线。

PSD模型：参考导师唐启盛教授[8-9]方法复制PSD模型。首先建立脑卒中模型，手术1周后，单笼饲养，并予21 d慢性不可预知温和应激(CUMS)，包括：禁食24 h、禁水24 h、潮湿垫料24 h、昼夜颠倒、夹尾1 min、束缚3 h、鼠笼倾斜24 h，每种方法使用3次。

PSA模型：脑卒中模型术后1周，采用不确定性空瓶饮水应激复制卒中后焦虑模型。术后经1周适应期后，进行定时喂水训练7 d，每天早9:00～9:10和晚21:00～21:10给动物饮水，其他时间撤去水瓶不给水。第8天至第21天，进行应激实验，每天在上述2个时间段内，随机选取一个时间段给予空瓶刺激，另一时间段喂水，刺激的给予是无规律的，但维持1次/d。

VD模型[10]：建立MCAO模型后，大鼠常规饲养，28 d后进行水迷宫评价，(实验组大鼠平均逃避潜伏期-正常组组大鼠平均逃避潜伏期)/实验组大鼠平均逃避潜伏期>20%定为VD鼠，进入实验。

正常组：正常饲养。

1.2.2 干预方法 卒中组自手术1周后开始药物干预，观察组给予颐脑解郁方灌胃，模型组、假手术组均给予蒸馏水灌胃，灌胃剂量10 mL/kg，1次/d，持续2周。PSD组、PSA组、VaD组及正常组，于应激结束后开始药物干预，观察组给予颐脑解郁方灌胃，正常组、模型组、假手术组均给予蒸馏水灌胃，灌胃剂量10 mL/kg，1次/d，持续4周。

1.2.3 检测指标与方法 一般状态观察：每周观察大鼠的行为活动、精神状态、对外界刺激的反应性、被毛色泽、粪便、舌色等。大鼠体重增长情况测量：实验开始后，每周监测大鼠体重，并根据体重调整给药量。计算卒中组大鼠灌胃第1、2周以及PSD、PSA、VaD组灌胃第1、2、4周体重增长情况。

2 结果

2.1 一般状态观察结果 为更好地体现大鼠表征动态变化情况，观察结果根据时间顺序进行描述。见图1。

实验前，各组大鼠精神状态良好，对外来刺激反应灵敏，行为活跃，被毛致密紧披有光泽，麦粒型粪便且干稀适中，舌色淡红，舌下脉络不明显、呈淡紫色。

2.1.1 缺血性脑卒中组

2.1.1.1 术后1周 手术大鼠术后苏醒表现为弓背、少动或不动，行走时左侧肢体力弱，或向左侧转圈，或向左侧倾倒，抬头困难；精神状态萎靡不振，双眼黯淡无神，少数大鼠触之不动；竖毛；粪便麦粒型，粒细小，质硬色深。术后1周内，抬头困难表现逐渐减少至消失，肢体力弱、转圈、倾倒的表现趋于好转，少数大鼠弓背蜷缩、少动；精神状态、反应灵敏性好转，无触之不动表现；少数大鼠竖毛持续；粪便棕色麦粒型，质软；口鼻颜色较黯淡，爪甲及足底淡红色，耳廓微血管清晰淡红；舌色淡红。

假手术大鼠手术苏醒后活动度低，抬头困难，无偏瘫、追尾表现；精神状态差，双眼黯淡；竖毛；粪便麦粒型，粒细小，质硬色深。假手术大鼠术后7 d内行为活动、精神状态、被毛色泽、粪便等恢复正常。行为活跃，双眼眼大红亮、动眼灵活，毛色纯白，被毛致密紧披有光泽，粪便棕色麦粒型，质软；口鼻润泽、呈淡粉色，爪甲及足底淡红色，耳廓微血管清晰淡红；舌色淡红。

2.1.1.2 术后2周 模型组大鼠活动度略低于假手术组，精神状态稍差，部分大鼠眯眼；被毛色白，欠光泽，少数大鼠竖毛；粪便棕色麦粒型，质软；口鼻颜色稍黯淡，爪甲及足底淡红色，耳廓微血管清晰淡红；舌色淡红。

图1 实验流程图

卒中观察组大鼠活动度较前略增加；精神状态改善，双眼较模型组红亮，动眼灵活；被毛色白，竖毛减少；粪便深棕色麦粒型，质软；口鼻颜色稍黯淡，爪甲及足底淡红色，耳廓微血管清晰淡红；舌色淡红。

卒中假手术组宏观表征较前无明显变化。

2.1.1.3 术后3周 模型组部分大鼠活动度减低，梳理次数减少，倦卧，精神状态转差，双眼黯淡，闻响后反应欠灵敏，口鼻颜色黯淡，舌色较前紫暗；同时可见部分大鼠攻击行为较前增加，舌色较前者红。少数大鼠出现浅棕色稀便。

卒中观察组大鼠无明显活动度减低、攻击行为增加表现，反应性可，闻响即抬头。粪便棕色麦粒型，质软，未见稀便。舌色淡红，口鼻颜色淡红。

卒中假手术组大鼠表征同前，无明显改变。

2.1.2 卒中后精神疾病组

2.1.2.1 术后2周 PSD大鼠出现明显的易激惹表现，束缚及夹尾时可见明显反抗、嘶叫、毛须竖立，抓取时反抗明显；被毛色白，竖毛；束缚时，大鼠排泄行为增加，为棕色软便或稀便，未行束缚时粪便棕色麦粒型、质软；口鼻颜色稍黯，舌色淡红。

PSA大鼠探究行为、攻击行为明显增多；反应灵敏性高，轻微响声即抬头；被毛色白，竖毛不明显；粪便棕色麦粒型，质硬。舌少津，色淡红。

VaD大鼠行为活动较前无明显改变，精神状态稍差，部分大鼠双眼黯淡无神，被毛色白，欠光泽，少数大鼠竖毛。粪便棕色麦粒型，质软。舌色淡红。

2.1.2.2 术后3周 PSD大鼠活动度较前减低，修饰行为减少，精神状态转差，束缚及夹尾时反抗、嘶叫程度减低，挣脱束缚次数减少,出现脱毛现象，被毛凌乱欠光泽。束缚时，大鼠排泄行为增加，为棕色软便或稀便，未行束缚时多为棕色麦粒型软便，偶见稀便。口鼻黯淡，舌色稍显紫暗。

PSA大鼠探究行为、攻击行为持续，修饰行为减少，有明显啃咬鼠笼行为，抓取反抗明显，给水时段抢夺水瓶激烈。部分大鼠竖毛，被毛欠光泽。粪便麦粒型，粒小色黑质硬。舌红少津。

VaD大鼠自发活动减少，梳理次数减少，部分大鼠倦卧、对外界刺激反应性下降，被毛欠光泽，偶有稀便。舌润泽，舌色淡红。

2.1.2.3 术后4周 PSD大鼠活动度低，自发活动较少，倦卧、少动，喜蛰伏于鼠笼角落，精神状态差，眯眼、双眼黯淡，反应淡漠，闻响后不抬头，抓取反抗。被毛干枯杂乱无光泽，毛色白中夹黄，脱毛现象持续。形瘦。多为棕色麦粒型软便，偶见稀便。足底颜色偏紫，口鼻黯淡，舌色紫暗，舌下脉络清晰、呈青紫色。

PSA大鼠攻击行为、探究行为、修饰行为同前，鼠笼托盘内可见大量细碎饲料残渣(为大鼠啃咬饲料但不食入所致)。抓取时呈弓背抬头的攻击姿态，抓取反抗激烈、嘶叫。形瘦，竖毛，被毛欠光泽，脱毛。粪便麦粒型，粒小色黑质硬。口鼻黯淡，舌红少津。

VaD大鼠少动、扎堆、倦卧、不活跃，精神状态较差，闭目趴卧时间较长，对外界刺激反应性下降，行动略迟缓，被毛色白欠顺滑，时有稀便。口鼻色稍暗，舌润泽，舌色淡红。

2.1.2.4 术后5～8周 PSD模型组、假手术组大鼠经灌胃后行为活动、精神状态、被毛色泽等均较灌胃前无明显差异。

PSD观察组大鼠经灌胃后，较应激后活跃，于角落蜷缩蛰伏等表现减少，对外界刺激兴奋性增加，脱毛现象明显减轻，被毛较前顺滑，稀便现象减少。舌色稍暗，舌下脉络淡紫。

PSA模型组、假手术组大鼠停止应激并灌胃后无抢夺水瓶表现，探究行为较前减少，攻击、啃咬鼠笼行为略减少。稀便增多，肛周污染明显。脱毛。舌较前润泽，舌红。

PSA观察组大鼠探究行为减少，梳理次数增加，攻击及啃咬鼠笼行为明显减少，抓取反抗程度减低，脱毛现象减少，粪便质软色棕。舌体润泽，舌色淡红。

VaD模型组大鼠经灌胃后，行为活动、精神状态、被毛色泽等均较灌胃前无明显差异。舌多津，舌色淡红。

VaD观察组大鼠经灌胃后，自发活动、梳理次数增加，精神状态改善，倦卧减少，稀便现象减少。舌体润泽，舌色淡红。

2.2 大鼠经灌胃后体重测量结果

2.2.1 卒中组大鼠体重测量结果 见表1。卒中组及正常组大鼠体重均呈现上升趋势。治疗1周后，卒中观察组较模型组体重略有升高，但无明显差异。模型组、观察组体重显著低于假手术组、正常组，差异有统计学意义(P<0.01)。治疗2周后，观察组与模型组比较，体重有明显上升，差异有统计学意义(P<0.05)，且与假手术组比较无显著差异。模型组与假手术组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。在治疗1周后及2周后时点上，卒中各组体重均显著低于正常组，差异有统计学意义(P<0.01)。

表1 卒中组大鼠体重测量结果

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与假手术组比较，△P<0.05，△△P<0.01

表2 PSD组大鼠体重测量结果

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与假手术组比较，△P<0.05，△△P<0.01

表3 卒中后焦虑组大鼠体重测量结果

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与假手术组比较，△P<0.05，△△P<0.01

表4 血管性痴呆组大鼠体重测量结果

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与正常组比较，△P<0.05，△△P<0.01

图2 卒中后精神疾病发展示意图

2.2.2 PSD组大鼠体重测量结果 见表2。各组大鼠体重均呈上升趋势。治疗1周及2周后，PSD观察组较模型组体重均有升高，但不具有统计学差异，且模型组、观察组体重显著低于假手术组、正常组，差异有统计学意义(P<0.01)。治疗4周后，中药组较模型组体重有显著上升，差异有统计学意义(P<0.05)，仍明显低于假手术及正常组，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。各时点假手术组体重均低于正常组，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.2.3 PSA组大鼠体重测量结果 见表3，治疗4周内，各组大鼠体重呈上升趋势。治疗1周及2周后，模型组、观察组、假手术组之间无统计学差异。治疗4周后，模型组大鼠体重明显低于假手术组，差异有统计学意义(P<0.05)，观察组与假手术组间无统计学差异。各时间点，正常组与PSA各组比较，体重均显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)。

2.2.4 VaD组大鼠体重测量结果 见表4，各组大鼠体重总体呈上升趋势。在治疗1周、2周、4周时间点上，模型组大鼠体重均显著低于正常组，观察组体重略高于模型组，但二者间差异无统计学意义。

3 讨论

3.1 卒中后精神疾病的发展演化及颐脑解郁方的立方依据 前期临床及基础研究发现，脑卒中患者发病后可出现情绪不稳、认知功能受损、思维迟滞、注意力下降及睡眠障碍等精神症状组群[11]，据其特征表现可归属于阈下抑郁、阈下焦虑或早期痴呆的范畴，其中部分患者最终发展为卒中后精神疾病。据此，唐启盛教授提出，PSD、PSA、VaD是由卒中后精神症状组群阶段发展而来。见图2。

中医认为，中风病的发展转归，由内风、痰浊、邪热、瘀血等病因与机体正气相争及其消长、变化的结果所决定。中风病后，若肾精亏耗，气虚痰阻，血行不畅，筋脉失养，则可出现行动迟缓、记忆力减退等症状；肝郁气滞，痰瘀气结者，可见郁郁寡欢等症状；气郁化火，郁火痰热，扰乱心神者，又可出现烦躁焦虑、担忧紧张等表现。随着病程迁延，若心神失养，营血受损，肝郁加重，可出现心情抑郁、时时欲哭、悲观绝望、失眠等抑郁症表现；气郁化火，灼伤阴津，肝肾阴虚，心失所养则可出现坐立不安、烦躁担心及汗出、心悸、手抖等一系列植物神经症状的焦虑样表现；病程缠绵，瘀久致虚，气血亏耗，髓海不足，又可导致痴呆症状的出现，如情感淡漠、反应迟钝、认知功能障碍等。

究其病机之根本，不外乎气机阻滞、脑络痹阻属实；气血不足、肾精亏虚、脑失所养属虚。根据中医理论，并结合多年临床经验，唐启盛教授认为，中风后情志疾病证属本虚标实，肾精亏虚为本，气机壅滞为标。其治疗当以补肾疏肝、调气通络、解郁安神为治疗原则，以此立补肾调气之法，以固本解郁为要，而又虚实兼顾，组成复方颐脑解郁方。临床应用于中风后情志疾病，收效满意。颐脑解郁方由刺五加、五味子、郁金、栀子组成，方中刺五加益气健脾，补肾安神；郁金疏肝解郁，行气活血，清心安神；五味子益气生津、补肾宁心；栀子泻火除烦。四味药物共奏补肾调气之功效。现代药理学研究同样提示上述药物具有一定的脑保护作用，方中刺五加包含的苷类物质具有减缓脑缺血损伤、抗疲劳作用[12-13]，郁金包含的主要活性成分为姜黄素类及挥发油两大类，具有抗抑郁功效[14]；五味子的主要活性成分五味子乙素具有保护脑神经的作用[15]；栀子的活性成分具有抗焦虑活性及神经保护作用[16]。

3.2 脑卒中向PSD、PSA、VaD演化过程中的表征变化趋势 在本研究中观察到，卒中模型组大鼠在术后3周时宏观表征出现分化，部分大鼠倦卧、精神状态萎靡、对外界刺激反应性下降，同时可见部分大鼠攻击行为较前增加。这与前期研究中精神症状组群阶段具有相同表现。此外，研究结果可见脑卒中向PSD、PSA、VaD发展演化过程中，大鼠的宏观表征变化趋势确有不同。

卒中大鼠向PSD演变过程中，首先出现明显的易激惹表现，如束缚及夹尾时反抗、嘶叫、毛须竖立、窜叫不安，抓取时呈现站立攻击姿态、反抗激烈，而后攻击性、对外界刺激反应性、活动度均逐渐降低，至应激结束后，表现为少动、蛰伏于鼠笼角落，修饰行为少，对外界刺激反应性低，形瘦，被毛结缕、无光泽，足底颜色偏紫，口鼻黯淡，舌色紫暗，舌下脉络发绀。

卒中大鼠向PSA演变过程中，可见攻击性行为、探究性行为明显增加，而后出现修饰行为减少。至空瓶应激结束后，PSA大鼠表现为攻击性高、探究性高，抓取时嘶叫、反抗激烈，修饰行为少，形瘦，竖毛，粪便粒小色黑质硬。口鼻黯淡，舌红少津。

卒中大鼠向VaD演变过程中，呈活动度、精神状态、反应性逐渐下降趋势，至术后4周，表现为自主活动少，行动较迟缓，精神状态差，倦卧，对外界刺激兴奋性低，被毛色白欠顺滑。偶有稀便。口鼻色稍暗，舌润泽，舌色淡红。

3.3 益肾调气方药的干预作用及卒中后精神疾病的“病证结合”探索 动物模型是中医药基础研究的桥梁和重要载体，建立同时具有西医疾病病理和中医证候特点的“病证结合”动物模型是中医药研究中亟需解决的问题，并已逐渐成为中医实验动物模型发展的新方向。肾虚肝郁证是中医肾虚证与肝郁证的复合证，具有肾虚、肝郁的加和内涵。本研究结果可见，各组大鼠具有不同程度的自主活动减少、抓取反抗、对外界刺激兴奋性低、精神萎靡、泄泻、脱毛等表现，与《中医诊断学》中关于肾虚及肝郁证的描述“精神萎靡、久泻不止、发脱、情志抑郁、胁肋胀痛、急躁易怒”等相符合。除此之外，PSD、PSA、VaD模型大鼠宏观表征也不尽相同，各模型具有诸多特异性表征，提示各模型肾虚和肝郁的偏重有所不同。PSD大鼠活动度低、精神状态差、舌色紫暗、舌下脉络发绀，提示疾病证候偏重于肝郁；PSA大鼠攻击性高、抓取反抗激烈、舌红少津，提示偏重于肝郁化火；VaD大鼠活动度低、精神萎靡、时有稀便、舌淡，其证候类型偏重于肾虚。在应用益肾调气中药颐脑解郁方后，各模型大鼠在行为活动、精神状态、被毛色泽、粪便情况及体重等方面均有不同程度的改善，揭示了益肾调气方药对治疗脑卒中及卒中后精神疾病的有效性，并从药物反证的角度进一步验证了肾虚肝郁的证候模型。

本研究从动物宏观表征入手，对脑卒中及卒中后精神疾患的“病证结合”进行了初步探索，但尚缺乏客观指标的佐证，在下一步的研究中，可以运用现代检测指标进一步印证中医证候。就目前而言，明确的评价标准和公认的评价方法，需要我们在以后的研究中不断摸索和完善。

综上所述，本研究初步验证卒中后精神疾病在其演变过程中具有肾虚肝郁的共同病机，益肾调气方药颐脑解郁方对缺血性脑卒中及卒中后精神疾病具有一定疗效，并为脑卒中、卒中后精神疾病的“病证结合”研究提供实验依据。