加味温胆方对心肌缺血（痰浊血瘀证）大鼠细胞凋亡及 Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3表达的影响*

张丽丽 李 雁

（黑龙江省中医药科学院，黑龙江 哈尔滨 150036）

冠心病是冠状动脉粥样硬化使血管狭窄或阻塞，从而导致心肌缺血缺氧或心肌坏死的临床综合证［1-2］。本病多发于50岁以上人群，男性多于女性，病理基础是由于冠状动脉粥样硬化或斑块不稳定，使血流减少，出现心肌缺血为主要特征的临床综合征，它涵盖了从不稳定心绞痛到ST段抬高性心肌梗死和心肌缺血所致心脏性猝死的一系列临床急症［3］。中医学认为冠心病属于“真心痛”“胸痹”“胸痛”范畴，是痰浊血瘀证的起始阶段，由于津血同源，痰瘀相关；痰可致瘀，痰常夹瘀。津、血均为水谷精微化生而来，津液凝炼化浊可变为痰，血液运行不畅可化为瘀；饮食失调，脾胃损伤，运化失司，导致湿浊内生，湿浊久聚生痰。痰浊又可阻滞气机，致脉络不通，气血运行不畅，引发血瘀［4］。因此，心肌缺血是痰浊血瘀的早期阶段。心肌缺血再灌注中凋亡的发生是导致心肌损伤的重要机制之一［5］。心梗后细胞凋亡使心肌细胞数量持续减少，胶原支架断裂，心肌细胞代偿性肥大，心室壁变厚、扩张，心功能障碍，最终导致心力衰竭。B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）是细胞凋亡基因的调控者，以线粒体为调控凋亡单位，Bcl-2为抗调蛋白，其同源二聚体X蛋白（Bax）为促凋亡蛋白，Bcl-2/bax的比例常被衡量凋亡水平［6］。当Bcl-2/Bax基因表达降低时，线粒体通透性改变，进而细胞色素释放，凋亡诱导因子等可溶性膜间隙蛋白被释放，Survivin表达水平降低，启动Caspase级联反应和不依赖Caspase途径的方式参与凋亡的发生［7］。加味温胆方出自《医宗金鉴》，由半夏、陈皮、茯苓、甘草、胆南星、竹茹、苍术、延胡索、丹参、川芎、赤芍、牛膝、黄芪、节菖蒲组成，具有降低心肌耗氧量、舒张外周血管阻力的功效，具有化痰、祛除痰饮、解郁散结 、止痛消炎的疗效，同时还能改善缺血心肌氧的供求平衡，提高心肌作功效率［8］。本研究拟探讨加味温胆方对心肌缺血（痰浊血瘀证）大鼠细胞凋亡及 Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3蛋白及基因表达的影响，为心肌缺血（痰浊血瘀证）的治疗提供理论及临床依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级SD雄性大鼠100只，体质量（234.76±11.03）g，黑龙江省中医药科学院实验动物中心提供，许可证号：SYXK（黑）2016-0009。动物自由摄取饲料、自由饮水，自动控制昼夜循环（12/12 h），室温（26.0±3.0）℃。每周称质量1次。

1.2 仪器及试剂 加味温胆方组成：由半夏12 g，陈皮 20 g，茯苓 20 g，甘草 10 g，胆南星 15 g，竹茹 20 g，苍术 15 g，延胡索 20 g，丹参 20 g，川芎 20 g，赤芍15 g，牛膝 15 g，黄芪 30 g，节菖蒲 15 g。由黑龙江省中医药科学院制剂室加工而成，制作工艺为标准制干浸膏，每克干浸膏相当于生药8.62 g；根据成人剂量公式换算，大鼠用药量为成人的13.14倍，将药粉溶入蒸馏水，以10.0 mL/kg体质量灌胃，将药液浓度配制成为 10.0 g/mL。 Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3 Elisa试剂盒（规格为96反应单位，编号kit09874、kit32942、kit87643）购自上海邦奕生物科技有限公司；Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3（规格为 10 mL，编号 45098、34509、23489、10987、09876、43098、54091、09765）一抗、二抗购自上海信帆生物科技有限公司；DAB显色试剂盒（规格为5mL，编号9098）、热电MK3酶标仪均购自南京森贝伽生物科技有限公司；Qiagen 205311逆转录试剂盒、ABI：4472908染料法实时荧光定量试剂盒、购自宝生物工程（大连）有限公司；实时荧光定量Bio-Rad PCR FX653仪购自美国BIO-RAD公司。

1.3 分组与造模 根据体质量随机分为5组：空白组、模型组、加味温胆方低剂量组（5.0 mg/kg）、加味温胆方中剂量组 （10.0 mg/kg）、加味温胆方高剂量组（20.0 mg/kg），每组20只。空白组普通饲料喂养，每日0.9%氯化钠注射液灌胃。模型组、加味温胆方各剂量组高脂饲料配方（胆固醇1%，蛋黄粉15%，猪油15%，基础饲料69%）。模型组每日0.9%氯化钠注射液灌胃；根据预试验获得大鼠加味温胆方的药物半数有效量（ED）约为800 mg/kg，取大鼠加味温胆方ED的1/4（20.0 mg/kg）、1/8（10.0 mg/kg）、1/16（5.0 mg/kg）作为加味温胆方高剂量组、加味温胆方中剂量组、加味温胆方低剂量组，连续灌胃7周，每周记录体质量，调节并维持给药量；在第49天施冠状动脉结扎术，麻醉后开胸，暴露心脏，于冠状动脉左前降支完全结扎，心电图监测，以ST段弓背向上抬高评价结扎是否成功。

1.4 标本采集与检测 1）大鼠心肌凋亡细胞检测。试验结束后，颈椎脱臼处死大鼠，取心脏组织（剩余心脏组织-80℃冰箱保存），进行常规染色切片，末端脱氧核苷酸转移酶（TdT酶）介导的带荧光的dUTP缺口末端标记法（TUNEL）检测心肌凋亡细胞；MOTIC IMAGES AOVANCED3.2图像分析系统检测的平均光密度和目标总面积。2）免疫组化法测定Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3蛋白在心脏中的表达。5 μm的石蜡组织切片脱蜡，0.1 mol/L柠檬酸修复抗原，室温5 min后，3%的H2O2液常温阻断内源性过氧化氢酶活性30 min，微波修复抗原，PBS 常规冲洗，1%的 Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3 抗体工作液（稀释浓度 1∶200），4 ℃过夜，加入二抗（IgG），室温60 min，加链霉素抗生物素蛋白-过氧化物，PBS冲洗，DAB显色，苏木素复染，（40%、60%、80%、90%、95%、100%）梯度酒精脱水，二甲苯透明，封片。 Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3 蛋白主要定于细胞核，呈棕黄色。3）大鼠心脏Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3蛋白及mRNA表达的检测。将保存在-80℃冰箱中的心脏组织取出解冻。称取0.2 g心脏组织，加入少量液氮，在微波碾磨仪（5000 r/s）中迅速将其碾碎至粉末状；将组织粉末转入1 mL Eppendorf管中，加入 1.2 mL PBS（pH7.4），充分振荡混匀，2 000 g，4℃，离心20 min。仔细收集上清液。获取心脏组织匀浆后，采用ELISA法检测心脏组织中的Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3蛋白表达量。提取心脏组织总RNA并检测RNA纯度和浓度。UltraSYBR One Step RNA PCR Kit说明对待测基因进行Real-time PCR反应。引物序列及RT-PCR反应体系见表1，表2。

表1 Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3 引物序列

表2 RT-PCR反应体系

1.5 统计学处理 应用Epidata、SPSS19.0统计软件。凋亡光密度及面积、Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3 蛋白及mRNA表达以（±s）表示，分析前进行正态检验，若满足正态性，采用LSD-t两两检验，若不满足正态性，数据转换后再进行LSD-t两两检验，检验水准α为0.05。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠心肌病理组织比较 见图1。空白组心肌纤维排列整齐，间质血管无改变，未见心肌细胞变性、坏死。模型组心肌纤维波浪样改变、断裂，心肌细胞肥大，空泡变性。加味温胆方低剂量组见心肌纤维波浪样改变较强，心肌细胞空泡变性。加味温胆方中剂量组见心肌纤维中等程度波浪样改变，心肌细胞中度肥大。加味温胆方高剂量组心肌纤维排列紊乱轻微，未见心肌断裂，心肌细胞轻度肥大。

图1 各组大鼠心肌病理组织比较（HE染色，200倍）

2.2 各组大鼠心肌细胞凋亡光密度及面积比较 见表3，图2。与空白组比较，模型组及加味温胆方组各剂量大鼠心肌细胞凋亡光密度及面积均升高（P<0.05）；与模型组比较，加味温胆方组各剂量大鼠心肌细胞凋亡光密度及面积均降低，且随着加味温胆方组给药剂量的增加，凋亡光密度及面积逐渐下降，剂量-效应关系明显（P<0.05）。正常细胞核染蓝色，凋亡细胞核呈棕色，各组心肌凋亡数目与凋亡光密度及面积符合。

表3 各组大鼠心肌细胞凋亡光密度及面积比较（±s）

表3 各组大鼠心肌细胞凋亡光密度及面积比较（±s）

与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与加味温胆方低剂量组组比较，▲P＜0.05；与加味温胆方中剂量组组比较，＃P＜0.05。下同

组 别 n 光密度 面积（μ m 2）空白组 2 0 0.2 8 2 9±0.1 3 4 9 3.1 6 6 4±0.1 3 5 6模型组 2 0 0.3 8 5 9±0.1 7 3 6* 1 2.3 3 1 1±1.3 0 0 1*加味温胆方低剂量组 2 0 0.3 5 7 5±0.1 1 0 5*△ 8.9 3 4 7±0.1 8 9 1*△加味温胆方中剂量组 2 0 0.3 3 7 3±0.0 0 9 8*△▲ 6.8 1 3 5±0.1 9 3 4*△▲加味温胆方高剂量组 2 0 0.3 0 1 4±0.0 0 7 8*△▲＃ 4.4 3 3 1±0.1 7 7 6*△▲＃

图2 各组大鼠心肌细胞凋亡情况（TUNEL染色，400倍）

2.3 各组大鼠 Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3 蛋白表达水平的比较 见表4，图3～6。与空白组比较，模型组及加味温胆方组各剂量BCL-2、Survivin降低，Bax、Caspase-3升高（P<0.05）；与模型组比较，加味温胆方组各剂量组 Bcl-2、Survivin 升高，Bax、Caspase-3 降低，且随着加味温胆方组给药剂量的增加，Bcl-2、Survivin逐渐升高，Bax、Caspase-3逐渐降低，剂量-效应关系明显 （P<0.05）。 免疫组化法下，Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3 阳性表达为棕褐色，各组 Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3阳性表达情况与个蛋白表达水平符合。

表4 各组大鼠Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3蛋白表达水平比较（ng/g，±s）

表4 各组大鼠Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3蛋白表达水平比较（ng/g，±s）

组 别 n空白组 2 0模型组 2 0加味温胆方低剂量组 2 0 B c l-2 B a x S u r v i v i n C a s p a s e-3 1 8 3.6 7±1 5.6 3 1 3 9.4 6±5.5 7 1 4 5.7 7±6.4 6 4 7.1 3±1 5.9 5 7 1.1 4±1 6.7 8* 1 7 9.7 5±7.3 7* 6 7.8 6±6.9 8* 1 8 7.6 6±9.4 7*1 0 3.7 3±1 3.6 5*△ 1 6 9.3 5±8.8 8*△ 8 9.4 5±6.9 8*△ 1 3 4.1 4±1 2.7 4*△加味温胆方中剂量组 2 0 1 2 3.1 7±9 9.6 9*△▲ 1 4 6.3 1±1 2.7 6*△▲ 1 2 0.1 5±1 0.6 9*△▲ 6 3.2 3±1 0.7 3*△▲加味温胆方高剂量组 2 0 1 5 2.5 8±1 3.7 4*△▲＃ 1 4 2.8 1±9.6 0*△▲＃ 1 3 7.6 3±1 2.7 3*△▲＃ 5 7.4 5±8.7 6*△▲＃

图3 各组大鼠心脏Bcl-2表达情况（免疫组化染色，400倍）

图4 各组大鼠心脏Bax表达情况（免疫组化染色，400倍）

2.4 各组大鼠 Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3 mRNA表达水平的比较 见表5。与空白组比较，模型组及加味温胆方组各剂量Bcl-2、Survivin mRNA降低，Bax、Caspase-3 mRNA升高（P<0.05）；与模型组比较，加味温胆方组各剂量组Bcl-2、Survivin mRNA升高，Bax、Caspase-3 mRNA降低，且随着加味温胆方组给药剂量的 增 加 ，Bcl-2、Survivin mRNA 逐 渐 升 高 ，Bax、Caspase-3 mRNA逐渐降低，剂量-效应关系明显（P<0.05）。

图5 各组大鼠心脏Survivin表达情况（免疫组化染色，400倍）

图6 各组大鼠心脏Caspase-3表达情况（免疫组化染色，400倍）

表5 各组大鼠 Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3 mRNA 表达水平比较（ng/g，±s）

组 别 n空白组 2 0模型组 2 0加味温胆方低剂量组 2 0 B c l-2 B a x S u r v i v i n C a s p a s e-3 m R N A 1.9 4±0.1 1 1.4 5±0.1 3 1.7 6±0.1 7 1.1 3±0.2 1 0.5 6±0.1 3* 2.1 3±0.1 9* 0.9 8±0.1 2* 2.1 8±0.1 9*0.9 1±0.1 8*△ 1.8 7±0.1 4*△ 1.0 9±0.1 7*△ 1.8 7±0.1 8*△加味温胆方中剂量组 2 0 1.4 9±0.2 0*△▲ 1.6 9±0.2 1*△▲ 1.1 2±0.1 6*△▲ 1.5 2±0.0 9*△▲加味温胆方高剂量组 2 0 1.7 2±0.1 1*△▲＃1.5 9±0.1 0*△▲＃1.4 2±0.2 0*△▲＃ 1.3 2±0.1 0*△▲＃

3 讨 论

研究报道，2013年我国心肌缺血（痰浊血瘀证）患病率为414/10万，患者总人数高达120万人，而绝大部分患者（约72%～79%）出现不同心肌收缩、舒张功能障碍，继发引起输出量不足，患者3年内的生存率极低，则患者生存期中位数约为4.8年，因此对心肌缺血（痰浊血瘀证）发病机制及药物干预的研究尤为重要［9-10］。

凋亡的心肌细胞在细胞外降解，被巨噬细胞和邻近细胞吞噬，因此，凋亡在调节细胞和组织构造方面具有重要作用。在动物实验中已经证实，应用抗凋亡药物、细胞因子或采用基因治疗可减轻心肌缺血再灌注损伤。心肌细胞凋亡被认为是心肌缺血痰浊血瘀证发病过程中的重要环节，其与一系列凋亡因子、抗凋亡因子的紊乱表达密切相关［11］。 Bcl-2、Bax是调节心肌细胞凋亡的重要调控因子，Bcl-2是抑制细胞凋亡蛋白，Bax是促进细胞凋亡蛋白。Bcl-2和Bax可通过化学氢键彼此形成异二聚体或与同源二聚体，Bcl-2和Bax两者蛋白基因表达水平比例的多少是决定细胞是否凋亡的重要因素。在细胞中，当Bax表达量较高时，Bcl-2与Bax通过磷酸二酯脱氢键形成同源二聚体Bcl-2/Bax，促进细胞凋亡，当Bcl-2表达量较高时，则通过氢键形成异源二聚体Bcl-2/Bax，抑制细胞凋亡［12-13］。研究还发现［14］，Bcl-2、Bax 还可与自身形成二聚体，当Bcl-2通过自身结构域BH3形成Bcl-2/Bcl-2，维持凋亡分子在细胞的恒定，抑制细胞进入凋亡程序，而当Bax/Bax同源二聚体占优势时，可诱导细胞凋亡，Bax/Blc决定了细胞接受凋亡信号后细胞的存活与否，对心肌细胞凋亡的发生有重要意义。Survivin是Bcl-2、Bax调控下的重要凋亡抑制基因，Bcl-2/Bax的比例直接决定了Survivin的激活或抑制，Survivin通过内源性及外源性途径抑制细胞凋亡，Survivin直接抑制Caspasc-3和Caspasc-7的活性，来阻断各种刺激诱导的细胞凋亡过程，Survivin也可通过P21间接抑制Caspase；Survivin与细胞周期调控因子CDK4结合，导致CDK2/cyclin-E激活和核糖体（Rb）磷酸化，Rb磷酸化后启动细胞进入周期，加快G1/S期的转换进而阻断凋亡信号转导通路［15-16］。近年来，随着对心肌缺血（痰浊血瘀证）研究的深入，多项研究表明，心肌细胞过度凋亡以及 IL-3、Fas、Bax、Caspase-3、Caspase-7、Caspase-8、TNF、Survivin等细胞因子的异常表达与心肌缺血（痰浊血瘀证）密切相关。大鼠动物试验已证实，通过药物抑制心肌细胞的凋亡能有效治疗心肌缺血 （痰浊血瘀证），减轻其损伤［17-18］。

加味温胆方具有改善血管舒缩功能、抗凝、保护血管内皮细胞、抑制血小板凝聚、调节血脂、扩张血管、调节血压等药理学功效，从中医学角度上，具有化痰活血、益气养心的功效，能生新血，散瘀血于脉道［19-20］。本研究结果显示，空白组心肌纤维排列整齐，间质血管无改变，未见心肌细胞变性、坏死。模型组心肌纤维波浪样改变、断裂，心肌细胞肥大，空泡变性。加味温胆方低剂量组见心肌纤维波浪样改变较强，心肌细胞空泡变性。加味温胆方中剂量组见心肌纤维中等程度波浪样改变，心肌细胞中度肥大。加味温胆方高剂量组心肌纤维排列紊乱轻微，未见心肌断裂，心肌细胞轻度肥大。结合心肌细胞凋亡结果与空白组比较，模型组及加味温胆方组各剂量大鼠心肌细胞凋亡光密度及面积均升高；与模型组比较，加味温胆方组各剂量大鼠心肌细胞凋亡光密度及面积均降低，且随着加味温胆方组给药剂量的增加，凋亡光密度及面积逐渐下降，剂量-效应关系明显；说明加味温胆方能减轻冠心病大鼠的病理损伤，有效抑制心肌细胞凋亡，加味温胆方高剂量效果尤为明显。而心肌缺血（痰浊血瘀证）大鼠Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3mRNA及蛋白表达结果，与空白组比较，模型组及加味温胆方组各剂量Bcl-2、Survivin mRNA、 蛋白表达水平降低，Bax、Caspase-3 mRNA、蛋白表达水平升高；与模型组比较，加味温胆方组各剂量组Bcl-2、Survivin mRNA、蛋白表达水平降低升高，Bax、Caspase-3 mRNA、蛋白表达水平降低，且随着加味温胆方组给药剂量的增加，Bcl-2、Survivin mRNA、蛋白表达水平逐渐升高，Bax、Caspase-3 mRNA、蛋白表达水平，剂量-效应关系明显，说明加味温胆方能促进 Bcl-2、Survivin mRNA、蛋白的表达，抑制 Bax、Caspase-3 mRNA、蛋白的表达，进而抑制心肌细胞凋亡，且具有明显的剂量-效应关系。

综上所述，加味温胆方能减轻冠心病大鼠的病理损伤，抑制心肌缺血（痰浊血瘀证）大鼠细胞凋亡，其机制与加味温胆方能促进Bcl-2、Survivin mRNA、蛋白的表达，抑制Bax、Caspase-3 mRNA、蛋白的表达有关。