中风1号对急性脑出血大鼠神经功能和脑组织形态的影响*

孙德阳 朱永志 杨 洋 梁 群△

（1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江哈尔滨 150040）

脑出血具体是指非外伤性脑实质内血管破裂引起的出血［1］，病情急重，早期死亡率高，幸存者中多数留有不同程度的认知、运动和言语吞咽障碍等后遗症［2-3］。脑出血后在脑实质内形成血肿，血肿压迫进而对大脑神经功能造成损伤。西医治疗主要体现在脱水降颅压、调整血压、防止继续出血、加强护理维持生命功能等对症治疗上，效果不甚理想［4］。近年来中医辨证论治原则在脑出血治疗上的应用，又为其治疗提供了新的突破口［5］。前期实验研究发现中风1号能够明显降低急性脑出血大鼠血清NSE水平［6］。本研究旨在前期研究的基础上利用透射电子显微镜在亚显微结构上观察中风1号对急性脑出血大鼠出血灶周围神经细胞凋亡的影响，同时通过神经功能评分及脑组织含水量评估中风1号对大鼠神经功能的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD大鼠，雄性，体质量（250±20）g由黑龙江中医药大学实验动物中心提供，按SPF级别标准饲养，许可证号：SCXK（京）2016-0006。

1.2 试药与仪器 中风1号汤剂主要由水蛭10 g，生大黄5 g，泽泻10 g，三七粉10 g，生地黄5 g配伍而成（由黑龙江中医药大学附属一院制剂室通过水提醇沉法提取药物有效物质）；20%甘露醇 （石家庄四药有限公司，规格：250 mL/瓶，国药准字 H1302303）；注射用青霉素钠 （石药集团中药药业有限公司，规格：2.4 g/瓶，批号：024170286）。透射电子显微镜（H-7650型，HITACHI公司）；超薄切片机（EMUC7 型，Leica公司）；无水乙醇 （A500737，生工生物工程股份有限公司）；50%戊二醛（A500484，生工生物工程股份有限公司）；丙酮（179973，Sigma）；锇酸（RBS0085，榕柏生物）；包埋液（上海杰美基因医药科技有限公司）。

1.3 分组与造模 将50只雄性SD大鼠按随机数字表法分为5组，即中风1号组、甘露醇组、模型组、假手术组、空白组。假手术组为对照组，每组10只。分别观察各组动物用药前后神经功能评分、脑组织水含量、脑出血灶周围神经细胞情况。制备大鼠急性脑出血模型，用水合氯醛按0.4 μL/1 g腹腔注射的方式进行麻醉大鼠。大鼠麻醉后将大鼠按照俯卧位的姿势固定在立体定位仪上，仪器双侧耳棒固定大鼠耳部，同时将大鼠的口齿固定于立体定位仪的口齿沟上 （耳尖平面相对于口齿沟平面高约2 mm）［7］。固定好大鼠之后用手术刀暴露大鼠前囟点，在前囟点右3.5 mm，后0.2 mm用牙科钻直径约1.0 mm圆孔，切勿过深伤及硬脑膜。鼠尾医用酒精消毒后，用5 mL注射器抽取尾部动脉血约70 μL，然后用微量注射器抽取60 μL。后通过定位圆孔将血液缓慢注入大鼠脑内（20 μL/min），留针静置观察10 min。留针观察的同时包扎鼠尾取血处的伤口。无异样后拔针并用牙科用水泥封闭创口，同时在操作区域涂抹青霉素钠，缝合手术伤口，以防止感染影响指标变化［8］。假手术组：造模方法与上述相同，但是不向大鼠脑内注射血液。给药按成人剂量与人体质量换算系数的比例公式计算大鼠给药剂量。中风1号组：中风1号汤剂1.5 mL灌胃，每日2次；0.9%氯化钠注射液1 g/kg，每日2次尾静脉注射，术后持续给药5 d。甘露醇组：0.9%氯化钠注射液1.5 mL灌胃，每日2次；甘露醇1 g/kg，每日2次尾静脉注射，术后持续给药5 d。模型组：0.9%氯化钠注射液1.5 mL灌胃，每日2次；0.9%氯化钠注射液1 g/kg，每日2次尾静脉注射。假手术组：0.9%氯化钠注射液1.5 mL灌胃，每日2次；0.9%氯化钠注射液1 g/kg，每日2次尾静脉注射，术后持续给药5 d。空白组：0.9%氯化钠注射液1.5 mL灌胃，每日2次；0.9%氯化钠注射液1 g/kg，每日2次尾静脉注射，术后持续给药5 d。

1.4 标本采集与检测 1）神经功能评分：采用双盲法，各个时间点利用longa对各组大鼠进行神经功能评分，无神经功能障碍获得0分；对侧前肢弯曲，不能完全伸展获得1分；大鼠爬行时向对侧划圈，不能直线行走获得2分；大鼠爬行时向对侧倾倒获得3分；意识水平降低，不能自发爬行获得4分。所得分数越高其运动障碍越明显。2）脑组织含水量测定：采用干湿重法，取大鼠进行过量麻醉，直接断头后取脑，去除嗅球部分，立即使用分析天平称湿重，然后于90℃干燥24 h，再称脑组织干重。计算脑含水量（%）=（湿重-干重）/湿重×100%。3）脑组织病理切片制作：取大鼠脑部出血部位1 mm3处。立刻进行固定：2.5%戊二醛固定；用0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗15 min，漂洗3次；1%锇酸固定液固定2～3 h；用0.1 mol/L磷酸漂洗液漂洗15 min，漂洗 3次［9-10］。然后进行乙醇梯度脱水（在 4℃冰箱内进行）：50%乙醇，15～20 min；70%乙醇，15～20 min；90%乙醇，15～20 min；90%乙醇与 90%丙酮（1∶1），15～20 min；90% 丙 酮 ，15～20 min。 后 于 室 温 下100%丙酮，15～20 min，进行 3 次［11］。 包埋：纯丙酮与包埋液（2∶1）混合液，室温进行 3～4 h处理；纯丙酮与包埋液（1∶2）混合液，室温过夜；纯包埋液37℃，处理2～3 h。固化：37℃烘箱内过夜；45℃烘箱内处理12 h；60℃烘箱内处理24 h。超薄切片机切片50～60 nm后用3%醋酸铀-枸橼酸铅双染色，置于透射电镜下观察，拍片［12-13］。

1.5 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件。计量资料以（±s）表示，组间数据比较用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠术后0 d、5 d神经功能评分比较 见表1。模型组、中风1号组、甘露醇组大鼠术后0 d神经功能评分与空白组和假手术组差异有统计学意义 （P＜0.01），其中模型组、中风1号组、甘露醇组各组间数据差异无统计学意义（P>0.05），证明造模成功。模型组、中风1号组、甘露醇组大鼠术后5 d神经功能评分与空白组和假手术组差异有统计学意义（P＜0.01），中风1号组、甘露醇组与模型组差异有统计学意义（P＜0.01），中风1号组和甘露醇组差异无统计学意义（P>0.05）。

表1 各组大鼠术后0 d、5 d神经功能评分比较（分，±s）

表1 各组大鼠术后0 d、5 d神经功能评分比较（分，±s）

与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01

组 别 n 0 d 5 d空白组 1 0 0.0 0±0.0 0 0.0 0±0.0 0假手术组 1 0 0.0 0±0.0 0 0.0 0±0.0 0模型组 9 2.4 2±0.7 5 0** 3.2 5±0.5 2 8**中风 1 号组 9 2.4 0±0.9 8 8** 2.1 1±0.9 9 8**△△甘露醇组 9 2.3 9±0.8 6 5** 2.0 7±0.9 7 7**△△

2.2 各组大鼠术后脑组织含水量比较 见表2。模型组、中风1号组、甘露醇组大鼠术后5 d脑组织含水量与空白组和假手术组差异有统计学意义（P＜0.01），中风1号组、甘露醇组与模型组差异有统计学意义（P＜0.01），中风1号组和甘露醇组差异无统计学意义（P>0.05）。

表2 各组大鼠术后5 d脑组织含水量比较（±s）

表2 各组大鼠术后5 d脑组织含水量比较（±s）

与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

组 别 n 脑含水量空白组 1 0 7 7.2 5±0.3 8假手术组 1 0 7 7.2 8±.0.3 5模型组 9 8 3.3 8±0.6 2*中风 1 号组 9 7 9.8 2±0.8 5*△甘露醇组 9 7 9.2 0±0.7 6*△

2.3 各组大鼠脑组织病理切片 见图1。空白组大鼠出血灶周围神经元核膜完整，双层膜结构清楚，线粒体形态正常，基质密度适中，细胞内细胞器数量丰富，线粒体数量也较丰富；模型组大鼠出血灶周围神经元细胞膜破裂、不清楚，核固缩较明显，细胞器数量减少，线粒体肿胀、损伤较严重；假手术组大鼠出血灶周围神经元核膜完整，双层膜结构清楚，线粒体形态正常，基质密度适中，细胞内细胞器数量丰富，线粒体数量也较丰富；中风1号组大鼠出血灶周围神经元核膜完整、较清楚，少量线粒体肿胀，细胞内细胞器数量较少；甘露醇组大鼠脑出血灶周围神经元核膜双层结构完整，核有轻微固缩现象，少量线粒体发生肿胀，细胞内细胞器数量较少。

图1 各组大鼠脑组织病理切片（HV:80 kV，1000倍）

3 讨 论

脑出血后血液积聚于大脑表面，压迫脑组织，引发脑水肿，致使颅内压增大增高，且刺激脑膜引起无菌性脑膜炎反应。血液阻塞脑脊液循环通路还可发生梗阻性脑积水，外溢血液中还有多种活性物质，如5-羟色胺、儿茶酚胺、血红蛋白分解物等刺激血管和脑膜，诱发脑血管痉挛，使脑组织缺血出现意识障碍或脑梗死［14-16］。而目前西医的治疗主要集中在控制继续出血、降低颅内压、防止复发、去除病因和防止并发症等对症治疗方面，但脑出血起病急，病情发展迅速，发生机制复杂，以上治疗效果不甚理想，且预后效果不佳。中医学认为本病多因积损正衰，劳倦内伤，肝阳暴亢，情志不畅，肝气不舒，不得疏泄，肝郁化火，心火爆亢导致，最常见的诱因是气候骤变，劳烦过度，情志过激，饮酒饱食等。总体病机因上述因素致脑络之血破入脑室，新成“瘀血”阻络，现代医学手段也有与其相对应的诊断证明，如脑出血后凝血功能试验结果的改变，血液常规中血小板的改变，都证明急性脑出血后脑内血液流动性变慢［17-18］，故提出脑出血急性期非手术中医治疗的方法应该以祛瘀行水为主。

中风1号由水蛭 10 g，生大黄5 g，泽泻 10 g，三七粉10 g，生地黄5 g配伍而成，是朱永志教授在多年临床工作中总结的治疗急性脑出血有效的经验方，具有祛瘀通络之功效。水蛭主逐恶血、瘀血，现代药理研究表明水蛭的主要成分有氨基酸、肽类、抗血栓素、肝素等，具有抗凝、抑制血栓形成、抗血小板聚集、脑保护等作用［19］；生大黄逐瘀通经，现代药理研究表明大黄有明显的促进血凝作用，对微循环具有双向调节作用，能降低毛细血管通透性，能使血小板、纤维蛋白质增加，缩短出血和血凝时间［20］；泽泻利水渗湿，现代药理研究表明其含有泽泻醇A乙酸酯或泽泻醇B，能有效增加尿素和氯化物的排除，对降低颅内压起到一定作用［21］；三七粉化瘀止血，现代药理研究表明三七含有三七氨酸，能够有效缩短出血和凝血时间，具有抗血小板聚集及溶栓的作用，且有研究表明三七皂苷能够在氧糖剥夺模型中促进大鼠海马神经干细胞（NSCs）的增殖与分化，起到脑保护的作用［22］；生地黄清热凉血，养阴生津，现代药理研究表明地黄乙醇提取物所得的黄色针状结晶能缩短凝血时间［23］。纵观全方，诸药综合配伍，共奏活血祛瘀之功。

本研究是在建立急性脑出血大鼠模型的基础上，灌胃给予中风1号，并通过评估神经功能评分、计算脑组织含水量及透射电子显微镜下的观察，通过实验观察发现中风1号组术后5 d神经功能评分及脑组织含水量与模型组差异有统计学意义，说明中风1号能够降低神经功能评分，并降低大鼠脑组织含水量，起到脑组织保护的作用。单纯的中风1号组和甘露醇组差异无统计学意义，在西医上脱水降低颅内压的常用药物是甘露醇，但是甘露醇对肾脏的损伤越来越引起人们重视，且不宜长时间使用。电镜下发现中风1号组大鼠组织神经元超微结构明显好转，核膜完整程度、细胞器数量也较模型组明显增多。线粒体是细胞进行有氧呼吸的主要场所，被称作能量工厂，而且它除了为细胞提供能量以外，还参与细胞分化、信息传递和细胞凋亡等诸多环节，有研究表明线粒体在细胞凋亡环节处于中心地位［24-25］。本实验观察发现中风1号组线粒体形态、肿胀程度、基质密度、数量较模型组明显改善。推测其原因可能是中风1号能促进线粒体结构的恢复，为脑出血造成神经元损伤的修复提供能量，从而保护起到脑组织神经，促进预后的作用。