通腑化痰法对急性脑出血大鼠肝细胞凋亡的影响及对应激性肝损害的保护作用*

王 威 马 迪 杜泓森 侯季秋 黄乐曦 赵海滨

（北京中医药大学第三附属医院，北京 100029）

急性脑出血多发于老年患者，其病死率及致残率 极高。是目前威胁人类生命和健康的首要神经系统疾病，有数据显示在我国急性脑出血占脑卒中发病率21%～48%［1］，全球范围内急性脑出血占脑卒中发病率10%～15%［2］。急性脑出血应激性肝损害的发生率很高，而且具有极强的隐蔽性。肝脏是严重应激损伤的核心靶器官，也是引起和加重原发病并致死的至关重要的因素［3］。现代研究显示，肝脏病变机制中肝细胞凋亡起着重要的作用，因此可以认为肝细胞凋亡是造成肝脏损伤和肝脏疾病的中心环节。本试验建立SD大鼠脑出血模型，检测各组、各时相点大鼠肝功能水平、肝组织病理学改变及大鼠肝细胞凋亡率，遵循中医学“急则治其标”的原则，应用通腑化痰法，以细胞凋亡为切入点，探讨通腑化痰法对急性脑出血大鼠肝细胞凋亡的影响其及对应激性肝损害的保护作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 成年健康雄性SD大鼠，体质量（300±20）g，24只，由北京中医药大学东直门医院实验动物中心提供。动物许可证：SCXK（京）2012-0001。室内温度（23±2）℃，大鼠自由饮食和摄水。

1.2 药物与试剂 中药星蒌承气汤：由北京康仁堂中药有限公司提供复方颗粒剂（药物组成：大黄6 g，芒硝6 g，瓜蒌 12 g，枳实 8 g，胆南星 12 g，丹参 18 g）。Ⅶ型胶原酶（Sigma），TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒（Roche公司）。

1.3 分组与造模 大鼠脑出血模型制备：参照朱文焕等报道的方法复制脑出血模型［4-5］。取大鼠以10%水合氯醛行腹腔麻醉，俯卧位固定于立体定位仪上，定位参照《大鼠脑立体定位图谱》［6］，头顶备皮后消毒，暴露大鼠前囟并以此为中点，向右旁开4 mm，向后旁开1 mm，于颅骨表面处钻直径1 mm的小孔，用微量注射器抽取0.5 μL胶原酶，在立体定向仪引导下缓慢垂直注入脑组织5 mm，时间5 min左右，停留2 min，之后缓慢退针，缝合头皮切口。分组与给药：取SD大鼠24只按随机数字表法分为4组，每组6只，即正常对照组、脑出血模型组、通腑化痰组及葡醛内酯组。各组分别于脑出血术后3个时相点处死动物并留存标本。除正常对照组外，其余各组大鼠复制脑出血模型。各组大鼠术前2 d开始灌胃给予相应药物，每天1次，术前2 h加灌1次，各组大鼠术后每天灌胃1次，3个时相点处死前2 h加灌1次。

1.4 标本采集与检测 1）肝功能检测：于各时相点分别腹主动脉取血，肝功能检测由北京中医药大学第三附属医院检验科完成，采用日立7180全自动生化仪，试剂购自中生北控生物科技有限公司。2）肝组织病理检测：于各时相点取血后，冰上打开腹腔，分离取材肝右后叶组织。大鼠肝组织以4%多聚甲醛溶液固定24 h以上，石蜡包埋，制备6 μm组织切片，进行HE染色，在光学显微镜下观察肝组织病理情况。3）细胞凋亡检测：运用末端脱氧核苷酸转移酶介导，脱氧三磷酸尿嘧啶缺口末端标记法（TUNEL），具体检测流程严格按照Roche公司试剂盒步骤进行操作，DAB显色，后脱水透明，封片，镜下观察凋亡细胞。凋亡细胞的判定以显微镜下细胞核呈棕黄色着色为阳性细胞，未染成棕色为阴性细胞。

1.5 统计学处理 应用SPSS 20.0 for windows统计软件。计量资料以（±s）表示，组间计量资料比较采用单因素方差分析检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组肝功能检测结果比较 见表1，表2。通腑化痰组、葡醛内酯组及脑出血模型组血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（GOT）水平均有不同程度的升高，与正常对照组差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），但通腑化痰组及葡醛内酯组可明显降低大鼠血清ALT、GOT水平，与脑出血模型组差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。葡醛内酯组与通腑化痰组差异无统计学意义（P>0.05）。

表1 各组大鼠各时相点血清GOT、ALT水平比较（mmol/L，±s）

表1 各组大鼠各时相点血清GOT、ALT水平比较（mmol/L，±s）

与正常对照组同时间点比较，△P＜0.05，▲P＜0.05，*P＜0.01；与脑出血模型组同时间点比较，△▲P＜0.05，▲P＜0.05；与通腑化痰组同时间点比较，▲P>0.05

组别 时间 G O T A L T正常对照组 2 4 h 7 1.5 3±6.9 8 3 6.1 5±1 1.7 2（n＝5） 4 8 h 7 6.3 1±6.9 2 2 7.5 2±4.5 5 7 2 h 7 6.4 2±7.5 6 3 8.2 9±6.5 2脑出血模型组 2 4 h 1 3 4.2 4±4.1 2* 1 1 9.7 1±4 0.1 1*（n＝5） 4 8 h 1 3 3.0 5±4.5 6* 6 0.3 8±7.8 8*7 2 h 1 3 1.7 4±4.3 5* 5 6.5 7±1 0.2 3*通腑化痰组 2 4 h 8 4.8 7±2.7 5#△ 4 1.7 8±1 1.1 9#△（n＝5） 4 8 h 8 6.4 6±4.3 9#△ 3 8.9 2±7.2 7#△7 2 h 8 1.8 5±1.4 1#△ 4 2.7 6±1 0.1 2#△葡醛内酯组 2 4 h 8 1.7 3±3.2 6#△▲ 4 3.2 6±6.3 5#△▲（n＝5） 4 8 h 8 3.2 6±4.3 2#△▲ 4 1.2 1±1 0.3 9#△▲7 2 h 7 7.7 9±4.2 8#△▲ 4 4.2 7±7.4 2#△▲

表2 各组大鼠各时相点肝组织每视野细胞AI比较（±s）

表2 各组大鼠各时相点肝组织每视野细胞AI比较（±s）

与正常对照组比较，*P＜0.01，#P＜0.01；与脑出血模型组比较，#P＜0.05，▲P＜0.05

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2.2 各组肝组织病理学检查结果比较 见图1。肝组织病理检测显示，正常对照组大鼠肝组织表面光滑肝且边缘整齐，肝细胞组织结构完整，排列规则有序，无变性坏死等情况出现。脑出血模型组见肝脏组织结构不完整，肝细胞出现水肿变性、坏死，炎性细胞浸润。通腑化痰组和葡醛内酯组较脑出血模型组病变明显减轻，肝组织结构基本正常，炎性细胞浸润现象出现较少。

图1 各组鼠肝组织病理学的影响（HE染色，100倍）

2.3 各组TUNEL检测肝组织凋亡指数比较 见表2,图2。经TUNEL检测后，正常对照组大鼠肝组织仅见少量细胞凋亡，脑出血模型组各时相点均可见较多凋亡细胞，48 h可见凋亡细胞达到高峰，经通腑化痰法干预后，各时相点TUNEL阳性细胞明显减少，肝细胞凋亡数比较差异有统计学意义（P＜0.05）；葡醛内酯组肝细胞凋亡数与通腑化痰组差异无统计学意义（P>0.05）。

图2 各组大鼠肝组织细胞凋亡（20倍）

3 讨 论

急性脑出血是临床上最常见的一种脑血管疾病，其国内发生率呈现逐年上升之势，具有较高的致残率、致死率及复发率［7］。病情发展过程较快，临床上易出现缺血性脑损伤情况并遗留不同程度的神经功能障碍。随着我国社会经济的不断发展，人口老龄化水平不断增加，脑出血疾病的患者人数也呈逐年增长趋势，严重影响了患者的生活质量，给社会及广大患者家庭带来沉重的负担［8］。急性脑出血的发生机理多为脑组织损伤、全身炎症反应等，因此应以缓解炎症反应、降低颅内压、减轻脑水肿及预防继续出血为主要治疗原则［9］。当急性脑出血出现应激状况时，机体受到外源性或感染毒性物质损伤，引起初期炎症反应，导致机体产生内源性免疫炎性因子形成“瀑布效应”，创伤后肠道菌群易位和内毒素入血循环至肝脏，可损害肝细胞［10］。肝脏是人体内各种营养代谢和储存的总枢纽，也是机体调节应激反应的核心场所，最易受到炎性反应侵袭，并且在应激反应中起着至关重要的作用。肝细胞凋亡是各种病因导致肝损伤后，引起的肝脏疾病的早期病变，是基因控制下的肝细胞自主而有序地凋亡［11］。肝细胞凋亡是调节肝组织正常细胞更新、增殖及再生的重要机制，如果肝细胞过度凋亡会引起肝功能的衰竭，与此同时也是造成肝脏损伤以及肝脏疾病的关键环节。由此可见，肝细胞凋亡是肝脏实质发生损伤的最直接的证据，抑制肝细胞凋亡是防治急性脑出血后应激性肝损害的有效途径，因此本试验中将其作为观察指标，探讨通腑化痰法对调节肝细胞凋亡的作用及对脑出血肝损害的保护机制。

中风总属本虚标实，急性期以标实为主，主要诱因为卒然卧倒，气机壅滞；情志不遂，气机不畅；多食油腻、饮食不节等，多由痰热闭窍、痰热瘀阻等证转变而来，痰、瘀、风、火互结为主要病机，气血逆乱，而致脏腑功能异常，邪实蕴而发热阻滞于中腑，故以血瘀痰热腑实证者多见，所以治疗上适宜用通腑化痰法。《金匮要略·中风历病脉证并治篇》中云“风引汤，除热瘫痫”［12］，方中大黄为其主药，意在通腑。《中藏经》有记载“人病中风偏枯，其脉数，而面干黑黧，手足不遂，语言謇涩，治之奈何？在上则吐之，在中则泻之……泻谓通其塞也，补谓益其不足也”［13］，明确提出通泻之法可治疗中风病。现代研究证实，通腑化痰法应用于中风急性期，通过脑肠轴机制而抑制炎性反应，调节血液流变学，改善新陈代谢，避免机体在应激的状态下遭受全身性炎性反应侵害［14］。本研究遵循了中医学“急则治其标”的原则，抓住“痰热腑实”，以细胞凋亡为切入点，应用通腑化痰法，选用星蒌承气汤，探讨中医药对急性脑出血应急性肝损害的干预机制及保护作用，为防治脑出血应激性肝损害提供重要途径。

本实验结果显示，通腑化痰组血清ALT、GOT水平与脑出血模型组相比显著降低。ALT和GOT主要分布于肝脏中，当肝细胞损害严重时ALT和GOT释放入血［15］，血清转氨酶活性是肝细胞损伤的敏感指标之一。星蒌承气汤可有效降低大鼠血清中ALT、GOT水平，明显减轻肝组织结构改变，减少炎性细胞浸润现象，表明通腑化痰法对急性脑出血大鼠应激性肝损害具有一定的保护作用。肝细胞凋亡广泛存在于各种原因导致的肝损伤的病理过程中，是细胞死亡的主要表现形式之一。在本实验中，通过各组大鼠TUNEL阳性细胞比较可见，脑出血模型组各时相点均可见较多凋亡细胞，48 h可见凋亡细胞达到高峰，经通腑化痰法干预后，各时相点TUNEL阳性细胞明显减少，肝细胞凋亡数比较有明显差异。现代研究证实，运用中医药治疗急性肝损害能够调节机体的免疫功能、保护肝脏细胞、改善肠道菌群失调、调节机体微循环［16］，还能够抑制全身炎症反应，对抗内毒素血症，最终可以改善患者的临床症状，提高疾病的生存率［17］。本研究结果显示，通腑化痰法能够明显降低急性脑出血大鼠肝损害细胞凋亡数，实验取得了较好的效果，由此可推测中药可能通过清除内环境中毒素、免疫复合物及炎性物质等作用，可以有效抑制炎症因子的释放及肝细胞凋亡，改善肝组织病理学结构，减轻急性脑出血肝脏损伤的程度，提高肝功能水平，对急性脑出血应激性肝损害具有保护作用。本实验为通腑化痰法中药治疗急性脑出血应急性肝损害提供有效的理论依据及新的治疗思路。