ZD制剂对马指浅屈肌腱炎模型的治疗效果

王 煜，罗园渠，杨珊珊，李云章

(内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古呼和浩特 010018)

近年来，国内马产业发展迅速，马术和赛马运动在国内正蓬勃发展。2016年国内举办各级别赛马和马术比赛超过100场，马匹竞技运动在国内发展日新月异。大量的训练和比赛导致马匹软组织损伤发病率很高，日本中央竞马会纯血马病例报告中有11.3%是指浅屈肌腱炎[1]，美国加州南部马场马匹该病发生率为15.3%[2]。

治疗马匹肌腱损伤主要是非甾体抗炎药，肌腱损伤治疗期长，长期用药胃溃疡发生几率上升，同时可能导致肾脏损伤、心血管疾病、结肠炎症和蹄叶炎等[3]。开发一种效果好、副作用低的治疗肌腱损伤的药物十分必要。

1984年Williams I F等[4]用马作为试验动物，对比了胶原酶诱导的肌腱炎和外伤性肌腱炎愈后疤痕组织的组织学和形态学特性，发现胶原酶诱导的肌腱炎的修复过程与外伤性肌腱炎的修复过程和愈后程度相似度较高，此后胶原酶诱导肌腱炎模型成为研究马肌腱炎的常用的模型[5-8]。

ZD制剂为内蒙古农业大学兽医学院验方，对动物软组织损伤具有良好的抗炎消肿、活血化淤、促进组织恢复、毒副作用低、安全性高等特点[9-10]。本研究选用马匹作为试验动物，建立马指浅屈肌腱炎模型，应用超声影像学方法探索ZD制剂对马匹软组织损伤的治疗效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验药品及试剂 ZD制剂膏剂，实验室自制；细菌胶原酶Ⅰ型，Sigma公司产品。

1.1.2 主要仪器 Mylab 30 Vet兽医B超机，Esaote公司产品。

1.1.3 试验用动物 健康蒙古马12匹，内蒙古农业大学动物园提供。

1.2 方法

1.2.1 试验马匹准备 将12匹马采用随机化分组，分为试验药物组、阳性药物组和阴性药物组3组，每组4匹。对试验马匹进行全身检查，左前肢进行视诊、触诊，跛行诊断，X光获取掌骨背掌位、正侧位图像，B超检测马匹指浅屈肌腱，横切和纵切图像各获取3张，测量数据，确保该肢正常。

1.2.2 马指浅屈肌腱炎模型诱导 静脉注射静松灵1.5 mL镇静马匹，剃去左前掌部毛发，然后用肥皂水洗和酒精消毒。将0.1 mL生理盐水稀释的26 800 u细菌胶原酶Ⅰ超声引导注入指浅屈肌腱内，50 g/L碘酊消毒。48 h内观察记录马匹精神、跛行情况、造模部位肿胀情况(图1)。

图1 注入胶原酶Ⅰ部位，图中标记部分为注射器针头

1.2.3 指浅屈肌腱炎模型治疗及评估

1.2.3.1 给药方法 造模后48 h，试验药物组马匹外敷ZD制剂，均匀涂布3 mm；二甲基亚砜配成90%液体[11]，外敷于阳性药物组，每匹马50 g；阴性药物组外敷生理盐水代替中药药液的膏剂。所有马匹每2 d换1次药。

1.2.3.2 检测方法 造模后48 h、7 d、15 d、30 d、45 d、60 d、75 d、90 d用B超检测肌腱损伤发展情况和愈合情况，使用B超机自带肌腱测量工具包，获取损伤部位肌腱整体横切图像面积、损伤区域面积。根据回声强弱，对损伤区域评分，评分标准[12]如下：正常回声0分，微弱低回声1分，轻度低回声2分，中度低回声3分，高度低回声4分。

1.2.4 数据统计分析 统计数据，应用SPSS22.0进行数据分析，数据以均数±标准差表示，使用方差分析进行差异性比较，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果

2.1 马匹试验前检查结果

临床检查试验马匹，造模部位触诊，局部无肿、热、痛，硬地慢步和快步检查未见跛行。X光检查见未见异常。B超检查见图2，指浅屈肌腱横切回声均匀，未见低回声区；纵切回声均匀，腱纤维连续，未见中断。B超检查未见异常。

2.2 马指浅屈肌腱炎模型造模结果

造模4 h后所有马匹均明显跛行，运步困难，造模肢体掌部肿胀明显。未镇静下触诊，躲闪拒绝检查。镇静后触诊，造模部位明显肿胀。造模后48 h，硬地慢步检查跛行明显。马匹不愿快步，快步检查无法进行。造模后48 h获取造模肢体X光背掌位和正侧位图像，未发现骨骼异常。造模后48 h扫查造模肌腱，横断面发现低回声区域，纵切面纤维排列遭到破坏，图3中箭头位置为损伤区域，指浅屈肌腱病变明显，符合指浅屈肌腱炎超声特性。

图2 造模前肌腱超声图像

图3 造模后肌腱超声图像

2.3 肌腱超声图像变化

图4～图13为试验药物组部分肌腱超声横切图和纵切图。

图4 造模后1 d试验药物组肌腱图像

图10和图11为阳性药物组部分肌腱超声横切和纵切图，图12和图13为阴性药物组部分肌腱超声横切图和纵切图。

图5 造模后15 d试验药物组肌腱图像

图6 造模后30 d试验药物组肌腱图像

图7 造模后60 d试验药物组肌腱图像

图8 造模后75 d试验药物组肌腱图像

图9 造模后90 d试验药物组肌腱图像

图10 造模后1 d阳性药物组肌腱图像

图11 造模后90 d阳性药物组肌腱图像

图12 造模后1 d 阴性性药物组肌腱图像

2.4 肌腱总面积变化

由图14可知，由于造模后肌腱发生肿胀，肌腱总面积在造模后15 d时最大，3组马匹肌腱总面积差异不显著(P>0.05)。

2.5 肌腱消肿效果

由图14和和表1可知，到造模后90 d，试验药物组肌腱面积缩小大于阳性药物组和阴性药物组，差异均极显著(P<0.01)。阳性药物组肌腱面积缩小大于阴性药物组，差异极显著(P<0.01)。

图13 造模后90 d阴性药物组肌腱图像

图14 肌腱总面积

组别Groups15 d肌腱面积/mm215 d tendon area90 d肌腱面积/mm290 d tendon area肌腱面积变化/mm2The change of tendon area试验药物组Test drug group76.00±1.5150.15±1.2426.04±1.11**阳性药物组 Posi-tive drug group78.33±1.2663.03±1.3315.15±1.06**阴性药物组 Nega-tive drug group76.99±1.3171.23±1.036.11±1.18

注：与阴性药物组、阳性药物组比较，**表示P<0.01。

Note:Compared with negative drug group and positive drug group,** indicatesP<0.01.

2.6 肌腱最大损伤面积

由图15可知，肌腱损伤面积在15 d时达到最大，3组肌腱损伤区域面积差异不显著(P>0.05)。

2.7 肌腱损伤愈合效果

由图15和表2可知，到90 d时试验药物组肌腱损伤面积为0 mm2，表明损伤愈合；而阳性药物组和阴性药物组肌腱损伤仍然存在。分别比较90 d时试验药物组与阳性药物组、阴性药物组的肌腱损伤区域面积变化，差异均极显著(P<0.01)。阳性药物组与阴性药物组比较肌腱损伤区域面积变化，差异极显著(P<0.01)。

图15 肌腱损伤区域面积

组别Groups15 d损伤面积/mm215 d tendon damage area90 d损伤面积/mm290 d tendon damage area损伤区域面积变化/mm2The change of tendon damage area试验药物组Test drug group9.08±0.250.00±0.009.00±0.58**阳性药物组 Posi-tive drug group9.15±0.236.09±0.243.00±1.17**阴性药物组 Nega-tive drug group8.38±0.148.32±0.190.42±0.39

注：与阴性药物组、阳性药物组比较，**表示P<0.01。

Note:Compared with negative drug group and positive drug group,** indicatesP<0.01.

2.8 肌腱超声回声评分

肌腱超声回声评分见表3。肌腱损伤在15 d达到最大值，对造模第15天各组肌腱损伤区域超声回声评分分别比较，差异不显著(P>0.05)。

造模第90天试验药物组损伤愈合，分别比较此时各组评分，试验药物组比阳性药物组、阴性药物组评分低，差异均极显著(P<0.01)，阳性药物组比阴性药物组评分低，差异显著(P<0.05)。

3 讨论

3.1 胶原酶诱导肌腱炎的机理和特点

肌腱由多级纤维性亚单位组成，胶原纤维组成初级腱纤维束，初级腱纤维束组成二级腱纤维束，二级腱纤维束组成肌腱。胶原蛋白占据肌腱干重的80%左右，其中有95%是Ⅰ型胶原蛋白。将细菌胶原蛋白酶Ⅰ注入肌腱后，胶原蛋白酶降解肌腱内胶原蛋白，使腱纤维的连续性遭到破坏，形成非开放性炎症。由于腱纤维的破坏、结构改变、炎症的产生，肌腱在拉伸和收缩时，产生剧烈疼痛，马匹呈现跛行。胶原蛋白酶诱导的肌腱炎模型亦具有一般炎症的红、肿、热、痛和机能障碍等临床症状。

表3 肌腱损伤区域超声评分

注：同行数据比较，*表示P<0.05，**表示P<0.01。

Note:Compared with the same line data,* indicatesP<0.05,and ** indicatesP<0.01.

由于机体代谢胶原蛋白酶需要时间和组织的修复，Wallis T W等[13]试验显示，胶原蛋白酶诱导的肌腱炎模型一般在14 d左右达到稳定。在14 d左右肌腱损伤面积基本趋于稳定，在此之前肌腱损伤区域面积一直在不断扩大。

腱纤维被胶原蛋白酶降解后，产生的炎性液体、腱纤维的断裂和出血导致超声扫查时肌腱回声强度发生改变，呈无回声或低回声状态；肌腱水肿，肌腱横断面积变大；纵切时肌腱厚度增加，纤维平行结构丢失[14]。损伤愈合时，损伤区域回声强度增强，横断面面积减小，纵切面纤维平行结构重建。

3.2 指浅屈肌腱炎模型的建立

本试验使用细菌胶原蛋白酶Ⅰ诱导的指浅屈肌腱炎模型，造模部位出现明显的肿胀、疼痛，造模肢体跛行明显。造模1 d后，超声横切图像出现明显低回声或无回声区，纵切图像可见明显腱纤维连续性遭到破坏，出现低回声或无回声区，符合肌腱炎模型超声特点[15]。各试验组肌腱总体面积、损伤区域面积在15 d达到最大值，且各试验组肌腱总面积、损伤区域面积无统计学差异，表明指浅屈肌腱炎模型平行性较好。综上所述，本试验诱导的指浅屈肌腱炎模型，符合肌腱炎的临床特征、超声影像特性和胶原酶诱导肌腱炎模型的特点，表明造模成功。

3.3 ZD制剂对指浅屈肌腱炎模型消肿效果

屈肌腱炎和悬韧带炎被俗称为“涨筋”，在外观上患部出现明显肿胀。炎症的肿胀是由局部组织充血和炎性渗出导致，指浅屈肌腱炎肿胀的产生在于腱束的断裂，胶原纤维间和疏松结缔组织内发生溢血，局部血管扩张，血管渗透性改变，血管内液体渗出，腱内组织液积聚，胶原纤维发生肿胀，造成局部水肿[8]。而胶原蛋白酶诱导的指浅屈肌腱炎模型通过胶原蛋白酶消化腱纤维，使腱纤维断裂、连续性破坏，导致溢血、血管通透性增强和腱内组织液积聚，使得造模部位发生明显的肿胀现象。

肿胀的消除代表着溢血的吸收、炎性水肿的消散和组织结构的愈合，是指浅屈肌腱炎改善的一个重要指标。由表1可知，ZD制剂对胶原蛋白酶诱导的指浅屈肌腱炎模型消肿效果极显著优于DMSO组和阴性药物组。

临床治疗指浅屈肌腱炎原则是减少渗出，促进吸收，防止腱束的继续断裂，恢复功能。ZD制剂中药组方中没药具有改善微循环和血液流变学的作用。当归活血补血、抗氧化和消除自由基。红花活血通经、散淤止痛；透骨草舒筋活血，祛风止痛。柏合[10]证明本ZD制剂具有降低血管通透性、改善微循环，缩短组织修复的时间，可显著改善炎症引起的肿胀。王未[9]和柏合[10]用ZD制剂治疗马肌腱炎模型时发现，ZD制剂显著降低炎症反应中炎性介质NO、COX-2、IL-1β和IL-6，降低炎症反应，提升IL-8和IL-10的含量，促进组织修复和再生。ZD制剂对胶原蛋白酶诱导的指浅屈肌腱炎模型消肿效果显著，可能与其良好的活血化淤作用和改善NO、COX-2、IL-1β、IL-6和IL-8、IL-10有关系。

而DMSO抗炎的主要机理是清除自由基，与抑制炎性细胞向发炎部位侵入作用共同完成[3,11]，不能在慢性炎症期较好地促进淤血、水肿消散，降解坏死组织，可能是DMSO治疗指浅屈肌腱炎效果不及ZD制剂的原因。

3.4 ZD制剂对指浅屈肌腱炎模型的组织重建作用

肌腱炎的恢复时，受损的部位逐渐形成新的纤维组织和肉芽组织，最后形成瘢痕愈合。愈合的肌腱损伤部位回声强度由低回声逐渐增强，预示着肌腱组织的重建[4]。本试验中，试验药物组超声图像中的肌腱损伤区域面积稳定减少，表明损伤区域的稳定减少；而且超声回声强度也同步逐渐增强，这预示着损伤肌腱炎性水肿的消散和新组织的再生。

由表2可以得知，ZD制剂对指浅屈肌腱炎模型受损面积改善上有着显著的效果。由表3则可以看出，使用ZD制剂的试验药物组受损肌腱的回声强度增强最快，ZD制剂对由胶原蛋白酶诱导的指浅屈肌腱炎模型组织重建效果明显高于DMSO组和阴性药物组。试验数据表明胶原蛋白酶可诱导马屈肌腱发生炎症。

ZD制剂外敷对胶原蛋白酶诱导的肌腱炎治疗效果优于DMSO组和阴性药物组。