副鸡嗜血杆菌贵州株的分离鉴定

林汉卿，温贵兰，汪德生，张升波，徐 丽，李昌红，文 明，周碧君，程振涛

(1.贵州大学动物科学学院/贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室，贵州贵阳 550025；2.思南县动物疫病预防控制中心，贵州铜仁 565100)

副鸡嗜血杆菌(Haemophilusparagallinarum，Hpg)又名副鸡禽杆菌(Avibacteriumparagallinarum,Apg)，是鸡传染性鼻炎(Infectiuns coryza,IC)的病原菌，该菌常引起鸡发生颜面肿胀、流鼻涕、呼吸困难和结膜炎[1]。传染性鼻炎是一种急性呼吸道传染病，主要危害育成鸡和产蛋鸡，可使蛋鸡产蛋量下降，肉鸡生长受阻、肉质下降，发病率高而病死率低[2]。鸡是本病的主要宿主，但也有其他禽类感染该病的病例[3]。该病呈世界性分布，1920年Beach第一次报道该病，我国从1980年起陆续有疑似病例出现，冯文达等[4]于1987年首次在我国分离到副鸡嗜血杆菌。副鸡嗜血杆菌属于巴氏杆菌科禽杆菌属[5]，是一种革兰阴性球杆菌，两极着色，无芽胞，无鞭毛，部分致病菌有荚膜[6]。该菌对生长要求较高，大部分菌株都有NAD(辅酶Ⅰ)依赖性，需要在培养基中添加NAD和血清[7]。Page通过凝集试验法将副鸡嗜血杆菌分为A、B、C 3个血清型，且各型之间不产生交叉保护[8]，目前我国主要流行的血清型为A型[9]。研究认为A型为主要致病血清型，C型菌株也存在不同程度的致病力，而B型是否致病还存在一定争议[10-12]。本试验从贵州一规模化土鸡养殖场疑似病例中分离到1株细菌，经分离培养、染色镜检、生化试验及16 S rRNA序列比对，鉴定其为C型副鸡嗜血杆菌，药敏试验筛选出了该菌的敏感药物，致病性试验表明，该分离菌为低致病性菌株。研究结果可为规模化养殖场副鸡嗜血杆菌的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

病料来自贵州某规模化养鸡场送检的疑似患病鸡；革兰染料、药敏片、生化鉴定管、营养琼脂，均为杭州微生物试剂有限公司产品；胎牛血清，海博生物有限公司产品；NAD，BBI公司产品；细菌DNA提取试剂盒，天根生化科技有限公司产品；2×EsTaqDNA Polymerase，康为世纪公司产品；DNA Marker DL 2 000，宝生物工程(大连)有限公司产品；葡萄球菌菌株,贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室保存菌株；10日龄小鸡,购自贵州大学农场。

1.2 方法

1.2.1 流行病学调查 观察送检病鸡的临床表现，询问养殖户流行情况，并对病鸡进行剖检，观察检剖病理变化。

1.2.2 细菌分离培养 在无菌条件下，用接菌环从送检鸡的心脏、肝脏、脾脏、肾脏和眶下窦等组织器官取样，接种于巧克力琼脂平板上，分别在厌氧与需氧条件下37℃培养24 h后，挑选单个菌落在含40 μg/mL NAD和50 mL/L胎牛血清的液体培养基进行纯培养。培养12 h后选择明显变浑浊的液体培养基进行革兰染色镜检。

1.2.3 卫星现象观察 吸取50 μL纯培养物于巧克力琼脂平板上，用LB棒涂抹均匀，然后用接菌环蘸取少量实验室保存的葡萄球菌在平板上划一条线，置于37℃培养18 h～20 h，观察是否出现卫星现象。

1.2.4 生化鉴定 用接种环接种纯培养菌液在细菌生化管内，在生化管中加入适量40 μg/mL的NAD和胎牛血清，于37℃培养48 h之后进行观察记录，生化鉴定结果判定参照说明书进行。

1.2.5 药敏试验 取100 μL纯培养菌液均匀涂抹于含NAD的巧克力琼脂平板上，用纸片法将头孢克洛、青霉素、四环素、头孢拉定、诺氟沙星、环丙沙星、卡那霉素、红霉素、复方新诺明、链霉素共10种药敏片粘贴于平板上，于37 ℃培养24 h，记录所有药敏片的抑菌圈大小，并根据表1的标准进行敏感性判定。

表1 药敏试验判定标准

1.2.6 16 S rRNA的PCR扩增与测序

1.2.6.1 引物设计 参考文献[13]合成1对细菌16 S rRNA通用引物，引物序列为上游引物：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′；下游引物：5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′，预扩增片段长度约为1 500 bp，引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司测序合成。

1.2.6.2 细菌DNA的提取及PCR扩增 参照细菌基因组DNA提取试剂盒操作说明书提取细菌DNA，用如下体系进行PCR扩增：上、下游引物各1 μL，2×EsTaqDNA Polymerase 12.5 μL，DNA 2 μL，H2O 8.5 μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性2 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 min，共30个循环；72 ℃ 2 min。反应结束后，经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并将PCR产物送英潍捷基(上海)贸易有限公司测序。

1.2.6.3 16 S rRNA序列分析 用DNA Star7.0软件将测得分离菌株的16 S rRNA序列与GenBank数据库中的标准副鸡嗜血杆菌菌株序列进行核苷酸同源性分析，并绘制遗传进化树。

1.2.7 动物感染试验 将细菌稀释于新的含NAD和胎牛血清的液体培养基中培养18 h～20 h，用同样的培养基进行101、102、103、104倍稀释。用涂片法取原液及每种稀释度的菌液分别各100 μL，均匀涂抹在巧克力平板上，每种浓度做3个平行，置于37℃的培养箱培养12 h～18 h后进行菌落计数。将未免疫过传染性鼻炎的10日龄小鸡随机分成6组，每组3只。分别取0.1 mL液体培养基、细菌原液及每种稀释度的菌液接种于各组小鸡的眶下窦，每日观察小鸡发病情况，并取其内脏及鼻窦分泌物进行细菌的分离培养。

2 结果

2.1 发病情况及临床症状调查结果

该养殖场存栏10 000多只鸡，日死亡20只左右，发病鸡可见精神沉郁、部分可见颜面肿胀、流泪、流清亮鼻液、呼吸啰音。观察送检鸡，可见眼部肿大、流脓液，鼻腔流清亮鼻液，关节轻微肿大。剖检送检鸡，可见肝脏有白色病灶，心包积液，心脏肿大，脾脏肿大且有大理石样病变(图1和图2)。

2.2 细菌分离培养及革兰染色结果

经37℃厌氧及需氧培养24 h后，从病例所有组织分离到的细菌在普通琼脂平板上均不生长。肝脏及眶下窦分离菌在巧克力琼脂平板上均长出半透明、露珠状、边缘整齐的小菌落，将其命名为HPG-GZ-2017，其他组织未分离到。革兰染色镜检结果显示，该分离菌为两极浓染的革兰阴性短小杆菌。

2.3 卫星现象观察结果

培养18 h后，在HPG-GZ-2017与金黄色葡萄球菌同时存在的巧克力琼脂平板上，可见靠近葡萄球菌的分离菌菌落较大，而远离葡萄球菌的菌落则相对较小(图3)。

2.4 分离菌生化试验结果

HPG-GZ-2017硝酸盐还原试验阴性；硫化氢、吲哚试验、靛基质试验阴性；过氧化酶试验阴性而氧化酶试验阳性。该菌能发酵甘露糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖产酸不产气；不能发酵半乳糖。

图1 病鸡眼睑肿大、流脓

图2 肝脏有白色病灶

图3 分离株形成的卫星现象

2.5 分离菌药敏试验结果

HPG-GZ-2017对头孢克洛高敏，对红霉素中敏，对四环素、环丙沙星、卡那霉素、青霉素、诺氟沙星、头孢拉定低敏，对复方新诺明、链霉素耐药(表2)。

2.6 分离菌16 S rRNA PCR扩增结果

经凝胶电泳检测，分离株HPG-GZ-2017的16 S rRNA PCR扩增结果与预期相符，片段长度约为1 450 bp(图4)。

2.7 分离菌16 S rRNA序列分析结果

测序得到1 437 bp大小序列，将所得序列与GenBank数据库中的各亚型标准副鸡嗜血杆菌菌株进行比对，核苷酸同源性为93.6%～99.4%。

2.7.1 核苷酸同源性分析结果 核苷酸同源性分析表明，HPG-GZ-2017与嗜血杆菌标准菌株CAPM 5113(GenBank：DQ229071)的同源性高达99.4%，与C型标准菌株HP107(GenBank：GU951544)、CAPM 5111(GenBank：M75056)、Modesto(GenBank：AY498870)的同源性都相对较高，分别为98.0%、98.2%、98.0%，与A、B型标准菌株的同源性在93.6%～97.3%之间(图5)。

表2 分离细菌药敏试验结果

M.DNA 标准DL 2 000; -.阴性对照；1～2.分离物

M.DNA Marker DL 2 000; -.Negative control；1-2.Isolates

图4分离株PCR鉴定结果

Fig.4 PCR identification results of isolates

2.7.2 系统进化树分析结果 系统进化树分析显示(图6)，HPG-GZ-2017与C型标准菌株CAPM 5111(GenBank：M75056)处于同一小分支，亲缘关系最近，与A型标准菌株M10071(GenBank：AY613734)、M9919(GenBank：AY613739)以及B型标准菌株M6755(GenBank：AY613719.1)、M10816(GenBank：AY613725)亲缘关系最远。

2.8 动物感染试验结果

将HPG-GZ-2017菌株接种各组10日龄小鸡，4 d后各梯度试验组和对照组鸡均食欲正常，精神良好，没有复制出IC典型特征症状。而各稀释度菌株接种的巧克力琼脂平板在24 h后均长出很密集的透明小菌落，根据计数原则全判定为多不可数。将试验组鸡处死并剖检，其内脏均未出现明显病变，蘸取眶下窦分泌物接种于巧克力平板培养后长成与初分离菌形态一致的菌落，革兰染色形态也与初分离时的形态一致。

图5 分离菌株HPG-GZ-2017株16 S rRNA序列同源性比对结果

图6 分离菌株HPG-GZ-2017 16 S rRNA序列系统进化树

3 讨论

本试验的病料来源于贵州省某规模化养殖场，病鸡有眼睑肿大、流鼻液及呼吸困难等症状，与传染性鼻炎典型症状相符。剖检可见心包积液，这可能与A、C菌株分离的多糖有关[14]。另外，本试验同时从病鸡体内检测到了禽白血病病毒病原核酸，这很可能是引起病鸡肝脏出现白色结节的原因。

该分离菌在未加NAD的血平板上不生长，在同样未加NAD的巧克力平板上生长良好。这是因为巧克力平板制作过程中红细胞会破裂，进而释放出有利于该菌生长的Ⅴ因子(NADH)。在该菌与产NAD的葡萄球菌交叉划线的巧克力平板上可见明显的卫星现象，这些现象表明，该分离菌株具有NAD依赖性，这是鉴别该菌的重要依据[15-16]。细菌菌落为边缘整齐的半透明小菌落，革兰染色可见该菌为红色的两极浓染的短小杆菌，都符合副鸡嗜血杆菌的特性。生化试验结果表明，HPG-GZ-2017不能发酵半乳糖，且不含过氧化氢酶，说明该菌为副鸡嗜血杆菌，而非其他禽杆菌[16]。由以上结果基本可判定该分离菌为副鸡嗜血杆菌，将其命名为HPG-GZ-2017。序列分析结果表明，HPG-GZ-2017与嗜血杆菌标准菌株CAPM 5113(GenBank：DQ229071)的同源性高达99.4%，由此可确定该菌株为嗜血杆菌。该菌与C型标准菌株的同源性比与A、B两型标准菌株都高，且与C型菌株的亲缘关系最近，因此确定该菌株为C型嗜血杆菌。

将HPG-GZ-2017接种于未免疫传染性鼻炎疫苗的10日龄小鸡，4 d后可从小鸡体内分离到该细菌，但小鸡不发生明显病变，而贵州省某规模化养殖场的鸡可见明显的传染性鼻炎典型症状，这可能受多种原因的影响。虽然各个年龄段的鸡都可感染副鸡嗜血杆菌，但成年鸡的易感性远大于雏鸡[17]，试验鸡日龄过小可能是未能复制出IC特征症状的其中一个原因。另外，鸡场的饲养环境、感染剂量和感染方式等也可能是影响动物感染试验结果的原因。为探明危害鸡场鸡的主要病原，我们对鸡场送检鸡进行了一些常见的禽类病毒的病原核酸检测，发现病鸡体内含有高浓度的J亚型禽白血病病毒。禽白血病是一种免疫抑制病，可降低鸡的抵抗力，继发其他病原的感染。鸡场送检鸡患有禽白血病很可能是其出现典型IC症状的重要原因。药敏试验结果显示，HPG-GZ-2017对头孢克洛高度敏感，对大多数药物低敏或耐药，这与鸡场滥用抗菌药物有很大关系。防治传染性鼻炎，不仅要注重饲养管理、严格执行疫苗防疫，还应注意预防禽白血病、马立克病等免疫抑制性疾病的感染。