天麻钩藤饮对脑出血大鼠TLR4、NF-κB和IL-1β表达的影响

原 铁，郭永宁，蔡海荣，蔡鑫桂，张为章，陈冬杰，陈伯钧*

(1.广州中医药大学第二附属医院，广东广州 510006；2.广州中医药大学，广东广州 510405；3.深圳市龙岗区中医院，广东深圳 518116)

急性脑出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是指各种原因导致的脑实质内出血，ICH是急诊科和神经科常见的急危重症，具有发病急、病情重、致死率高等特点[1]。流行病学调查研究显示，我国ICH发病率占脑卒中的18.8%～47.6%[2-3]，仅次于缺血性脑卒中，居第2位，1月内死亡率高达35%～52%[4-6]，是我国居民致残、致死的最主要原因。脑出血后脑水肿和炎性反应是脑出血后继发性神经损伤的重要原因[7-8]。因此，如何有效地降低脑出血后脑水肿和抑制脑出血后炎性反应，是目前研究的热点。天麻钩藤饮广泛应用于脑出血患者，具有一定的疗效，但是对其保护脑神经的机制尚不明确。因此，本试验建立了大鼠脑出血大鼠模型，用天麻钩藤饮进行干预，观察了其对神经功能缺损评分、脑组织含水量和血清Toll样受体4(TLR4)、核转录因子-κB(NF-κB)和IL-1β表达水平的影响，探讨了天麻钩藤饮保护脑出血后神经功能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 60只SD健康雄性大鼠，SPF级，3～4个月鼠龄，体重250 g～300 g，广东省医学实验动物中心提供，许可证号为SCXK(粤)2013-0002。

1.1.2 药品 天麻钩藤饮(天麻15 g，钩藤15 g(后下)，石决明30 g(先煎)，栀子15 g，黄芩15 g，川牛膝10 g，杜仲10 g，益母草10 g，桑寄生10 g，夜交藤10 g，茯苓10 g)；将上述中药饮片加8倍量的水煎煮1 h，再加6倍量的水煎煮1 h，2次药液过滤后混合，置100℃环境浓缩至1 mL相当于原药6 g。

1.1.3 试剂和仪器 大鼠血清TLR4 ELISA试剂盒，上海江莱生物科技有限公司产品；NF-κB ELISA试剂盒，IBL公司产品；IL-1β ELISA试剂盒，Sigma-Aldrich公司产品；大鼠头颅立体定向仪(ST-5 ND-C)，中国成都仪器厂生产；微量注射仪，北京博奥森试剂有限公司产品；电热恒温水浴箱(DHG-905385-Ⅲ)，上海新苖医疗器械有限公司产品；HM-200电子天平，日本三洋公司产品；显微外科手术器材，上海手术器械厂生产。

1.2 方法

1.2.1 分组和造模 大鼠造模前先适应性喂养7 d，待其代谢状态稳定后随机分为假手术组(n=20)、模型组(n=20)和天麻钩藤饮组(n=20)，每组按造模后1、3、5、7 d 4个时间点分为4个亚组，每组5只大鼠。参照段晓春[9]的方法建立脑出血模型：采用100 g/L水合氯醛(0.4 mL/100 g)腹腔注射麻醉后，俯卧位固定于脑立体定向仪上，暴露颅骨，在前囟点右旁3.5 mm和后0.2 mm交点处，用直径1 mm的牙科钻钻至硬脑膜，经静脉留置针，进针至尾状核，尾动脉采血50 μL，先注入10 μL，停针2 min，再缓慢注入40 μL，留针4 min，退针2 cm ,再停针4 min，缓慢出针。缝合切口，消毒。假手术组与模型组、天麻钩藤饮组的操作方法相同，但不注血，注入等量的生理盐水。

1.2.2 给药方法 天麻钩藤饮组分别在术前24 h和术后予以天麻钩藤饮18 g/kg·d灌胃，1次/24 h，直至死亡为止。假手术组和模型组分别在术前24 h和术后予以腹腔注射等量生理盐水，剂量为3 mL/kg·d，1次/24 h，直至死亡为止。

1.2.3 观察指标

1.2.3.1 神经功能缺损评分 参照Berderson标准，分别在各术前和术后各时间点进行神经功能缺损评分。0分：无体征；1分：动物脑部病灶对侧腕关节、肘关节屈曲，肩内收屈曲；2 分：上述体征加上向麻痹侧推阻力下降；3分：活动时向麻痹侧追尾；4分：意识障碍，无自发运动。

1.2.3.2 脑组织水含量测定 脑组织水含量(brain water content，BWC)采用干湿比重法，断头取大脑前部组织后立即测湿重(精确到0.10 mg)，然后将同一组织置入恒温箱中烘干24 h，再秤干重，干湿重量均用电子天平测量。

BWC(%)=(湿质量-干质量)/湿质量×100%。

1.2.3.3 血清TLR4、NF-κB、IL-1β表达水平测定 分别在试验1、3、5、7 d开胸经心脏取血，运用ELISA检测血清TLR4、NF-κB、IL-1β的水平(由金域医学检验中心有限公司按照试剂盒说明书步骤进行检测)。

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能缺损评分的结果

与假手术组相比，模型组1、3、5、7 d各时间点的神经功能缺损均明显升高(P<0.05)；与模型组相比，天麻钩藤饮组1、3、5、7 d各时间点的神经功能缺损均明显降低(P<0.05)(表1)。

2.2 各组大鼠脑组织水含量的检测结果

与假手术组相比，模型组1、3、5、7 d各时间点的脑组织水含量均明显升高(P<0.05)；与模型组相比，天麻钩藤饮组1、3、5、7 d各时间点的脑组织水含量均明显降低(P<0.05)(表2)。

注：与假手术组相比，*P<0.05；与模型组相比，△P<0.05。

Note：Compared with the control group，*P<0.05；Compared with the model group，ΔP<0.05.

表2 各组大鼠脑组织水含量的检测结果

注：与假手术组相比，*P<0.05；与模型组相比，△P<0.05。

Note：Compared with the control group，*P<0.05；Compared with the model group，ΔP<0.05.

2.3 各组大鼠血清TLR4、NF-κB、IL-1β的检测结果

假手术组血清中TLR4、NF-κB、IL-1β表达水平无明显变化，模型组和天麻钩藤饮组术后血清TLR4、NF-κB、IL-1β表达水平均有所升高，均在脑出血后3 d达到高峰后随着时间推移呈不同程度的下降。在术后1、3、5、7 d各时间点，模型组血清TLR4、NF-κB、IL-1β表达水平明显高于对照组(P<0.05)；天麻钩藤饮组在术后1、3、5、7 d各时间点血清TLR4、NF-κB、IL-1β表达水平明显低于模型组(P<0.05)(表3)。

表3 各组大鼠血清TLR4、NF-κB和IL-1β的检测结果

注：与假手术组相比，*P<0.05；与模型组相比，△P<0.05。

Note：Compared with the control group，*P<0.05；Compared with the model group，ΔP<0.05.

3 讨论

目前脑出血的机制尚不完全明确，近年来炎性反应在脑出血的病理生理中的重要性越来越受到重视。脑出血后脑水肿和炎性反应是脑出血后继发性神经损伤的重要原因。因此，如何有效地降低脑出血后脑水肿和抑制脑出血后的炎性反应，可以更好地保护其神经功能。

Toll样受体(TLRs)是一类重要的天然免疫受体家族一个新发现的有高度保守序列而古老的天然免疫受体家族，其在炎症反应调控中具有重要的作用，表现在调节免疫应答、促炎症介质合成和释放、促细胞成熟和分化等方面[10]。TLR4作为一种具有多种生物活性的跨膜受体，在炎症反应中具有重要的调节作用，具有促凝血、提高白细胞黏附能力、增加血管通透性等。已有研究表明，TLR4参与了脑缺血和脑出血后的炎症反应。其导致脑损伤的机制可能是各种缺血缺氧、氧化应激等物质刺激TLR4的大量释放，大量释放的TLR4作用于神经细胞，并通过对NF-κB的转录调控，进一步刺激IL-1β等炎症因子的释放，促进炎症瀑布反应形成，炎症因子可以刺激白细胞等释放更多的炎症介质，形成脑损伤的恶性循环[11]。NF-κB是一种具有多向性转录激活功能调节分子，其可以通过调节炎症相关性基因的转录表达从而介导炎性反应。NF-κB既是TLR4胞内信号传导通路最重要的下游分子，也是促进IL-1β等炎症因子合成和释放最重要的上游分子。研究表明，脑出血后细胞外信号与TLR4结合后诱导NF-κB活化，NF-κB激活后进入细胞核内与DNA结合，通过对IL-1β等炎症因子的转录调控，使炎症介质过表达并最终形成炎症瀑布反应，而IL-1β同时又是NF-κB的激活剂，因此形成恶性循环作用，导致持久的炎性反应加重神经损伤[12]。IL-1β是一种具有多种生物学活性的细胞因子，其在机体炎症启动、维持和消退中都起着非常重要的作用。研究表明，IL-1β可以通过与中性粒细胞表面的受体结合，增强其毒性，促进黏附因子合成和释放，诱导化学趋化因子升高，导致炎症介质聚集到病灶部位，加重炎症反应[13]。还有研究表明，IL-1β可以凋亡而加重脑组织损伤。

脑出血属于中医学“中风”范畴，天麻钩藤饮主要由天麻、钩藤、石决明、栀子、黄芩、川牛膝、杜仲、益母草、桑寄生、夜交藤、茯苓组成，具有平肝熄风，清热活血，补益肝肾之功效的作用[14]。天麻钩藤饮广泛应用于脑中风，具有良好的效果，可以提高临床有效率、减轻脑水肿，保护神经元等[15]。但是对天麻钩藤饮保护脑出血后神经元的机制尚不完全明确。本试验观察了天麻钩藤饮对脑组织含水量的影响，研究表明，术后模型组和天麻钩藤饮组均出现脑组织水肿的现象，术后3 d达到高峰后出现不同程度的下降，而天麻钩藤饮组脑水肿下降的程度明显优于模型组。本试验测定大鼠血清TLR4、NF-κB、IL-1β的表达水平，模型组在术后1、3、5、7 d各时间点血清TLR4、NF-κB、IL-1β的表达水平高于假手术组，天麻钩藤饮组在术后1、3、5、7 d各时间点血清TLR4、NF-κB、IL-1β的表达水平明显低于模型组。提示天麻钩藤饮可能通过抑制TLR4、NF-κB、IL-1β的表达，抑制炎症反应和减轻脑水肿来促进脑出血后大鼠神经功能的恢复。

综上所述，天麻钩藤饮具有促进大鼠脑出血后神经功能恢复的作用，可能与减轻脑水肿和抑制TLR4、NF-κB和IL-1β介导的炎症反应有关。