2016年辽宁规模化猪场病毒性腹泻流行状况调查分析

关 淼，赵晓彤，周晨阳，顾贵波，杨本勇，李井春，赵凤菊，杨洺阳，申贯男，李 蓉，王宏燕，张 健，梁 乔

(辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁省动物医学研究院，辽宁沈阳 110164)

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)、猪传染性胃肠炎(Porcine transmissible gastroenteritis，TGE)和猪轮状病毒(Porcine rotavirus，PRV)感染分别是猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Porcine transmissible gastroenteritis virus，TGEV)和猪A群轮状病毒(Porcine rotavirus group A，PRV-A)引起的以猪呕吐、腹泻、脱水为特征的传染病，具有较高的致死率，给生猪养殖带来了重大的经济损失[1-6]。感染上述病毒后患猪临床表现极为相似，猪群中一旦出现猪发病，很快就会波及全群，尤其在感染仔猪以后的高发病率和高死亡率，给猪场带来毁灭性打击。同时，还存在多种病原混合感染，成为一个引人注目的世界性的新问题。辽宁省是全国养猪大省，猪腹泻病在辽宁省猪群出现新的流行特点，散养户、养殖专业户及小规模饲养场流行时间短，而大中型规模场流行时间较长，新生仔猪发病率和病死率极高。因此，控制猪腹泻病成为保证养猪业稳定发展的关键。本研究通过对辽宁省猪群腹泻疫病的流行状况、流行特点等进行调查分析，掌握本地区疫病流行态势，为猪群腹泻疾病的科学防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

核酸提取试剂盒、一步法RT-PCR试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、pMD18-T载体、DNA marker等均购自宝生物工程(大连)有限公司；PEDV、TGEV、PRV-A三重实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司；荧光定量PCR仪(7500 Fast)购自美国ABI公司；PCR仪(C1000)购自美国Bio-Rad公司；电泳仪(DYY-6C)购自北京六一仪器厂；凝胶成像系统(Gel Doc XR+)购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 调查对象、样品采集及处理 根据各地生猪饲养量的不同，按照随机抽样的原则，分别于2016年3、6、9、11月份，在辽宁省每个地市(县)调查规模猪场1个～2个，共调查全省14个地市58个县(市)的规模猪场70个。每个猪场用棉签采集10份不同窝的仔猪粪便样品，置于15 mL离心管中，在-20℃保存，共计700份粪便样品。

1.2.2 问卷与现场调查 设计了调查问卷，内容包括：养殖场(户)名称、联系人、地址、电话等基本信息；存栏量、饲养方式、仔猪来源、仔猪断奶日龄等基本情况；防疫设施、圈舍通风情况、消毒情况、除粪情况、免疫情况等防疫状况、病死动物无害化处理方式；腹泻发病猪群、发病率、死亡率、腹泻发病原因、是否进行实验室诊断等腹泻发病及死亡情况。每个采样场(户)填写1份调查表。

1.2.3 PEDV、TGEV、PRV-A三重实时荧光定量RT-PCR检测 将采集到的仔猪粪便按照1∶5的比例使用PBS进行稀释，颠倒混匀后静止5 min，吸上清备用。按照RNA提取试剂盒说明书要求提取样品总RNA。之后按照 PEDV、TGEV、PRV-A三重实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒说明书要求对700份粪便样品进行猪腹泻3种疫病的实时荧光RT-PCR检测。

1.2.4 PEDV S1基因扩增及序列测定 参照GenBank国内外已注册的PEDV病毒株的S1基因序列以及外文文献，合成1对引物，上游引物序列为：5′-ATGTTGTGTTAGGCTTGTTG-3′，下游引物序列为：5′-ACTAACAGGCGTGTTGTAA-3′，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。选取经PEDV、TGEV、PRV-A三重实时荧光定量RT-PCR检测后，PEDV阳性结果中Ct值较小的阳性粪便样本，按照RNA提取试剂盒说明书重新提取样本总RNA，并进行PEDV S1基因全序列RT-PCR扩增。RT-PCR反应体系为50℃ 45 min；94℃ 2 min；94℃ 30 s、50℃ 30 s、72℃ 2.5 min，共34个循环；72℃ 10 min。产物经10 g/L琼脂凝胶电泳鉴定、纯化后克隆到pMD-18T载体后，阳性质粒由宝生物工程(大连)有限公司测序。

1.2.5 PEDV S1基因核酸序列分析 用DNAStar软件对测定的PEDV S1基因序列进行拼接和编辑，应用MegAlign软件对测定的核苷酸序列与从GenBank中选取国内外的16个S1基因参考序列进行同源性比较，并绘制遗传进化树，进行系统多样性及遗传变异分析。

2 结果

2.1 问卷调查猪腹泻发生情况

共计调查70个规模猪场，其中发生过腹泻猪场41个，占58.6%(41/70)，未发生过腹泻猪场29个，占41.4%(29/70)。进行过实验室诊断的有18个场(户)，占25.7%(18/70)。发病原因中，大肠埃希菌感染占发病场(户)的56.1%(23/41)；PEDV占发病场(户)的26.8%(11/41)；TGEV占22%(9/41)；原因不清楚的占34.1%(14/41)；其中其他原因有昼夜温差大，奶水不足，断奶应激等。使用抗生素治疗效果明显的14个场(户)，占发病场(户)的34.1%(14/41)；效果一般的20个场(户)，占48.8%(20/41)；治疗无效的7个场(户)，占17.1%(7/41)。发生腹泻的猪场里，随着养殖规模的增加，腹泻发生的比例逐渐下降，但存栏量3 000头～4 999头的猪场发生腹泻的比例比存栏量1 000头～2 999头的猪场高。其中存栏量在3 000头～4 999头的腹泻流行率最高为78.9%，存栏量超过10 000头的养猪场的腹泻流行率为50%(表1)。

表1 不同规模猪场腹泻发生情况

2.2 猪腹泻发生的群间分布情况

本次问卷调查中发生腹泻的场(户)均有哺乳仔猪发生腹泻症状，发生率为100%(41/41)，哺乳仔猪共计83 314头，发病10 142头，发病率为12.2%，死亡3 786头，死亡率为4.5%；调查发生腹泻的场(户)保育仔猪发生腹泻比率为39%(16/41)，但是发生头数少，发病率为3.5%，死亡率为1%(表2)；其他日龄的猪无发生或表现为一过性症状。表明猪腹泻主要集中发生于哺乳仔猪，保育仔猪次之，在饲养生产中，应该注意哺乳仔猪圈舍的卫生及保温情况，以减少哺乳仔猪腹泻的发生。

2.3 哺乳仔猪腹泻发生的时间分布情况

按照问卷调查结果，针对哺乳仔猪进行时间分布上的数据分析，显示在2016年中，11月份的发病率最高，为35.9%，6月份发病率最低，为1.4%(表3)。结果表明仔猪腹泻一年四季均可发生，但不同季度差异较大，寒冷的冬春季节发病率最高，应在冬春交际加强哺乳仔猪的饲养管理。

表2 哺乳仔猪和保育仔猪腹泻发病及死亡情况

表3 2016年4个季度哺乳仔猪腹泻发病及死亡情况

2.4 哺乳仔猪腹泻发生的空间分布情况

对辽宁省14个市按照问卷调查结果进行哺乳仔猪发生情况分析，其中，盘锦、葫芦岛、营口地区的发病率和死亡率最高，发病率分别为44.9%、29.9%和29.9%，死亡率分别为8.8%、21.2%和16.3%；而本溪、铁岭、阜新的发病率最低，分别为0.7%、2.4%和2.6%，死亡率分别为0.4%、0.2%和0.4%(表4)。将辽宁地区按照地理位置划分为4个区域，问卷调查结果按照区域进行统计(表5)，统计结果显示，发病率辽西最高(24.9%)，辽东最低(2.8%)；死亡率辽西最高(7.3%)，辽东最低(0.6%)。表明不同地区仔猪腹泻病的发病率差异较大，在制定全省免疫策略时应有所侧重，针对不同地区制定不同的防疫策略，在日常监测工作中对仔猪腹泻发生率高的地区应加强检测。

表4 辽宁省不同市哺乳仔猪腹泻发病及死亡情况

表5 辽宁省不同区域哺乳仔猪腹泻发病及死亡情况Table 5 Morbidity and mortality of diarrhea of suckling piglets in different areas of Liaoning province

2.5 PEDV、TGEV、PRV-A三重实时荧光定量RT-PCR检测结果

对70个场(户)共计700份粪便样品进行PEDV、TGEV、PRV-A三重实时荧光定量RT-PCR检测，检测结果2016年4个季度中只有第一季度检测到猪腹泻病毒核酸阳性，其余3个季度检测结果均为阴性。2016年第一季度中采集了25个场(户)，每个场(户)10份，共计250份粪便样品，荧光RT-PCR检测结果见表6。由表6数据可知，PEDV样品阳性率为36%(27/75)，场阳性率为48%(12/25)；PRV-A样品阳性率为41.3%(31/75)，场阳性率为56%(14/25)；TGEV均未检出。表明在辽宁省范围内养猪场(户)仔猪病毒性腹泻主要由PEDV和PRV-A引起，在临床上要进行实验室诊断以确定致病原因，对症治疗，并有针对性的制定防疫策略。

2.7 PEDV S1基因核酸序列分析

将2016年测定的12株PEDV S1基因序列与GenBank中登录的16株国内外PEDV S1基因序列以及3株本实验室2015年测定的PEDV S1基因序列进行核酸序列比对分析发现，本研究中测定的2016年辽宁地区12株PEDV的S1基因4株全长为2376 bp，8株为2367 bp。

根据PEDV S1基因同源性分析，12株2016年辽宁PEDV分离株之间的同源性为92.6%～100%。其中辽东地区PEDV 3株分离株之间同源性为93.7%～99.9%，辽北地区PEDV 3株分离株之间同源性为97.5%～99.3%，辽南地区PEDV 3株分离株之间同源性为99.6%～100%，辽西地区PEDV 3株分离株之间同源性为93%～97.8%。分离株2016LNeast2与2016LNwest3同源性最低(92.6%)，2016LNsouth2与2016LNsouth3同源性最高(100%)。

12株2016年辽宁PEDV分离株与欧洲株CV777的同源性为91.3%～94.7%，与韩国株KNU-0802的同源性为91.2%～95.8%，与日本株83P-5同源性为91%～94.9%，与中国株LZC、CH8以及HuN株的同源性分别为90.5%～93.9%、92.5%～97.4%和92.1%～97.9%。

表6 2016年第一季度猪腹泻三重实时荧光定量RT-PCR检测结果

2.6 PEDV S1基因的扩增结果

RT-PCR产物经琼脂凝胶电泳分析显示，扩增出12条约2 300 bp的特异性片段，与预期大小相符(图1)。并按照供试病毒样本采集年份和区域将分别命名为2016LNeast1、2016LNeast2、2016LNeast3；2016LNwest1、2016LNwest2、2016LNwest3；2016LNsouth1、2016LNsouth2、2016LNsouth3；2016LNnouth1、2016LNnouth2、2016LNnouth3。

12株2016年辽宁PEDV分离株与3株2015年辽宁PEDV分离株之间的同源性为93.1%～99.6%，其中2015-2株与2016LNeast2株、2015-3株与2016LNwest1的同源性均为93.1%，2015-1株与2016LNsouth1株的同源性最高，为99.6%。

M.DNA标准DL 2 000；1～12.样品S1基因；13.阴性对照M.DNA Marker DL 2 000; 1-12.S1 gene of samples; 13.Negative control

2.8 PEDV S1基因序列遗传进化树分析

用MegAlign软件将12株PEDV S1基因序列与GenBank中已公布的国内外参考序列进行核酸序列比对，并构建系统进化树(图2)。通过系统进化树分析显示，PEDV可以分为3个亚群，除了2016LNeast2和2016LNwest1病毒株之外的其他10株PEDV辽宁分离株属于第3亚群，同属该亚群的还有6株中国其他地区PEDV分离株SH、YS、SD-QD-2015、CHGD-01、HuN、CH8，2株韩国PEDV分离株CNU-091222-01、KNU-0802，以及2015年3株辽宁PEDV分离株2015-1、2015-2和2015-3。其中2016LNnorth1、2，2016LNsouth1、2、3以及2016LNwest3与2015年3株亲缘关系较近，处于同一分支；2016LNwest2与SH、YS亲缘关系较近，2016LNeast1、3与SD-QD-2015亲缘关系较近，2016LNnorth3与CH8亲缘关系较近。2016LNeast2与4株中国其他地区PEDV分离株CH-JLGZL-2011、JS-2004-2、DX、LJB-03属于第2亚群。欧洲株CV777，2006年中国LZC株，韩国DR13株以及日本83P-5组成第1亚群。而2016LNwest1虽然与第1亚群，第2亚群处于同一大分支，但是又独立成一亚支。结果表明在辽宁地区不同时期的不同地区，有处以同一分支的优势毒株流行，又有不同进化来源分支的其他毒株存在，同时可能存在基因变异的新毒株。

3 讨论

本研究调查了辽宁省14个地市58个县(市)的70个规模猪场的腹泻流行情况，通过填写调查问卷和实验室检测分析，为辽宁省腹泻的诊断、免疫策略的制定以及防制提供参考和理论依据。问卷调查中调查的70个规模猪场，发生过腹泻场41个，场阳性率为58.6%；哺乳仔猪存栏83314头，发病率为12.2%，死亡率为4.5%。通过实验室检测，在第一季度的25个场(户)75份样品中，PEDV样品阳性率为36%(27/75)，场阳性率为48%(12/25)；PRV-A样品阳性率为41.3%(31/75)，场阳性率为56%(14/25)；未检出TGEV。说明在辽宁省范围内PEDV的场阳性率较高，应引起养殖户的注意，注重场的腹泻净化。

引起腹泻的原因是多种多样的，在问卷调查中，致病性大肠埃希菌感染也是引起腹泻发生的重要原因。因为很多养殖场(户)并未进行实验室诊断进行最后确诊，所以具体病因无法确定，PEDV可能与大肠埃希菌、PRV-A等引起腹泻的病原混合感染引起腹泻。猪群发生腹泻症状以后应该及时进行实验室诊断以明确感染病原，针对致病原因制定治疗方案，降低因为腹泻而引起的经济损失。

通过本研究调查，辽宁省不同地区的猪养殖场(户)均有不同程度的PEDV感染，多发生于第一季度，冬春交接之际，不同地区和时间PEDV、PRV-A的感染率不同，表明低温是激发腹泻发生的主要因素之一。在冬春气温较低，温差较大的季节，应该注意猪舍保暖，调节温湿度，降低因冷热温差而引起的应激反应。猪场的卫生环境对腹泻的发生也有至关重要的影响，改善养殖环境，及时清理尿污粪便，加强消毒，保持猪舍干净卫生。此外，提高仔猪免疫力，饲料中添加微生态制剂，都有利于降低腹泻类疾病的发生。

图2 PEDV S1基因系统进化树

通过多重荧光RT-PCR检测，辽宁省主要流行的是PEDV和PRV-A，其中PRV-A样品阳性率及场阳性率都略高于PEDV。刘云波等[7]2013年对全国13个省1282份临床腹泻样品进行检测，结果显示，PEDV、TGEV及PRV-A的阳性率分别为24.49%、2.65%和3.20%，表明PEDV仍然是临床引起仔猪腹泻的主要病原。同时，本研究结果及全国调查结果显示，PRV-A感染率出现了明显的上升趋势，需要在临床上注意鉴别诊断，在治疗上有针对性的制定治疗方案，同时加强PRV-A的防疫工作。

随着养猪业的快速发展以及集约化养殖方式的普及，近年来在冬春交际PED多次发生流行。虽然PEDV首次在欧洲发现，但是它已经导致多个亚洲养猪国家的重大经济损失，包括韩国、中国、日本、越南和菲律宾。并且从2013年4月以来，美国、加拿大和墨西哥都有PEDV大流行的报道[8]。而随着PEDV的流行，该病毒也在发生着变异，Yang D K等[9]通过对2014年在韩国发生的PED进行研究发现，一种新的PEDV变异株在韩国流行，与1998年的SM98分离株的同源性为93.08%。杜晓莉[10]通过对2010-2013年浙江省的临床腹泻样品进行研究表明，PEDV临床检出率由2010年的42.86%升高到2013年的70%以上，临床检测毒株的S1基因与传统毒株CV777的S基因以及中国最早检测的基因序列亲缘关系较远。

通过系统进化树可以看到，在辽宁地区不同时期的不同地区，有处以同一分支的毒株流行，说明这一分支的毒株为辽宁地区的优势毒株。同时又有不同分支的其他毒株存在，说明它们具有不同的进化来源。通过核酸序列比较发现第1亚群和第2亚群具有相似的基因变化和缺失，同时在不同位置有不同的碱基变化，而2016LNwest1与这两个亚群的基因变化类似，处于同一大的分支，但是它在第1596位碱基由T→C，在第1601位以及第1634位发生了碱基缺失，因此单独列一分支。说明PEDV在辽宁地区的发展过程中，基因发生一定的变化。

本研究通过对2016年辽宁地区规模化养猪场进行猪病毒性腹泻流行情况及PEDV分子流行病学的深入调查和研究，可以了解辽宁地区猪病毒性腹泻的流行状况，确定主要流行病毒，明确主要流行病毒的优势毒株及遗传演化规律，为辽宁地区猪病毒性腹泻类疫病高效疫苗的研发奠定基础，为辽宁地区猪腹泻的免疫实施方案的制定提供理论依据，为PEDV的科学防控提供可靠的技术保障。