新疆阿魏多糖和药桑多糖及其硫酸化产物体外抗新城疫病毒作用研究

2018-12-24赛福丁阿不拉德力拜尔木拉提

动物医学进展 2018年12期

赛福丁·阿不拉，德力拜尔·木拉提

(1.新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052；2.新疆维吾尔自治区动物卫生监督所，新疆乌鲁木齐 830052)

天然多糖含有增强免疫、抗癌细胞、抗病毒等多种生物活性效果[1-2]。新疆阿魏(FerulasinkiangensisK.M.Shen)和药桑(MorusnigraLinn )都是传统的维吾尔药材，新疆阿魏主要分布于我国的新疆，在民族医药中应用广泛，可治疗胃病、关节炎等，研究表明阿魏具有抗氧化，抗真菌和解痉降压等作用[3-6]。药桑的主要活性物质有多糖、色素[7]、黄酮[8]等，研究表明药桑的多种成分具有抗氧化作用[9]。Zhao X等[10]通过硫酸化修饰银耳多糖，发现经硫酸化修饰的银耳多糖在1.563 μg/mL时对NDV感染的CEF的病毒抑制率显著高于未修饰的银耳多糖。本研究以新疆阿魏和药桑的传统用药和现代药理学研究为依据，考察新疆阿魏多糖和药桑多糖及其硫酸化产物的体外抗新城疫病毒作用，研究修饰后其抗病毒活性是否得到提升，旨在得到新颖的高活性低毒性的硫酸化多糖，为新城疫病毒的防治提供理想的药物，为维吾尔药材的开发利用提供数据依据，同样也为维药的开发提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用鸡胚鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。

1.1.2 药品新疆阿魏根购自新疆民族医院，新疆药桑购自新疆阿克苏库车，多糖及硫酸化修饰物由新疆农业大学动物医学学院临床实验室提供。

1.1.3 主要仪器 CO2培养箱，美国eppendorf公司产品；TE2000-U型倒置显微镜，Nikon公司产品；SHE-3000型酶标分析仪，北京赛尔福知心科技有限公司产品；MM-2型微量振荡器，金坛市医疗仪器厂生产。

1.1.4 主要试剂 1640培养液、Hank's液，HyClone公司产品；小牛血清，江苏恩莫阿赛生物技术有限公司产品；四甲基偶氮唑蓝MTT溶液，Biosharp公司产品。

1.2 方法

1.2.1 多糖的制备将新疆阿魏多糖(Ferulasinkiangensispolysaccharide，FSP)和药桑多糖(Morusnigrapolysaccharide，MP)及4种修饰后多糖，分别是硫酸化新疆阿魏多糖取代度为0.7(sFSP0.7)、硫酸化新疆阿魏多糖取代度为1.9(sFSP1.9)、硫酸化药桑多糖取代度为2.5(sMP2.5)及硫酸化药桑多糖取代度为1.3(sMP1.3)，用PBS配制、高压灭菌、0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存备用。

1.2.2 新城疫病毒制备 NDV中等毒力活疫苗Ⅰ系，用9日龄SPF鸡胚接种并于48 h后收集尿囊液， Reed-Muench法[11]测定病毒对鸡胚成纤维细胞(CEF)的半数组织培养感染剂量(TCID50)为10-6，细胞维持液稀释成10-4(100 TCID50)备用。

1.2.3 鸡胚成纤维细胞的制备无菌取出9日龄～11日龄鸡胚，用Hank′s洗1遍，去除头、四肢和内脏。再用Hank′s洗2遍，在小烧杯中将组织剪碎，再用Hank′s液洗3遍。加入4 mL的2.5 g/L胰蛋白酶溶液，置37 ℃消化，每隔2 min～3 min轻轻摇晃烧杯，12 min后吸去胰蛋白酶溶液，终止消化。细胞计数调成1×106个/mL，加入到96孔细胞培养板，37℃、体积分数为5% CO2培养箱培养。

1.2.4 多糖安全浓度测定将制备好的新疆阿魏多糖(FSP)、药桑多糖(MP)、硫酸化多糖sFSP0.7、sFSP1.9、sMP2.5及sMP1.3分别自500 μg/mL浓度进行细胞维持液倍比稀释为11个浓度梯度。待CEF均匀生长为单层后，弃去培养基，用Hank's液清洗2次，上药，100 μL/孔，每个浓度重复4孔，设置对照(只添加细胞维持液)。72 h后，按MTT法[13]用酶联免疫检测仪测490 nm波长处的OD值。选择OD值不小于细胞对照组的最大浓度作为该多糖的最大安全浓度。

1.2.5 多糖在成纤维细胞上抗新城疫病毒的作用将FSP、MP及4种修饰后多糖sFSP0.7、sFSP1.9、sMP2.5及sMP1.3分别从安全浓度向下依次倍比稀释5个浓度。待CEF长成单层后，弃去孔内液体，用Hank's液洗3次，以3种方式加入各浓度多糖和病毒：①即先加多糖后接种病毒：每孔加入不同浓度的多糖100 μL，培养4 h后弃掉孔内液体，加入病毒液100 μL；②先接种病毒后加多糖：每孔加入病毒液100 μL，培养2 h后弃掉孔内液体，加入多糖100 μL；③多糖和病毒感作后加入：将病毒液分别加

入到各浓度的多糖溶液中37℃感作4 h，再加入到培养板中。同时设立细胞对照组(cell control，CC)和病毒对照组(virus control，VC)，3种加药方式的细胞均培养72 h后，按MTT法测定OD490nm值，并按以下公式计算病毒抑制率[12]：

病毒抑制率%=(OD(多糖+病毒)-OD(病毒对照))/(OD(细胞对照)-OD(病毒对照))×100%

2 结果

2.1 多糖对成纤维细胞的最大安全浓度

sFSP0.7在0.488 μg/mL～0.977 μg/mL、sFSP1.9在0.488 μg/mL～1.953 μg/mL、sMP2.5在0.488 μg/mL～3.906 μg/mL、sMP1.3在0.488 μg/mL、FSP在1.953 μg/mL、MP在3.906 μg/mL时的OD490nm值与细胞对照组(CC)差异不显著(P>0.05)，因此可选择这些浓度范围为该多糖的安全浓度(表1)。

2.2 先加多糖后接种病毒时NDV感染CEF的能力

检测新疆阿魏多糖、药桑多糖及其硫酸化修饰物对NDV的阻断作用，MP、FSP在0.244 μg/mL～3.906 μg/mL、sFSP0.7在0.977 μg/mL、sMP1.3在0.031 μg/mL～0.488 μg/mL时的OD490nm值与病毒对照组(VC)差异显著(P<0.05)(表2和表3)。表2中依次为先加多糖后加入病毒组、先加病毒后加入多糖组、多糖和病毒混合感作后加入组。

表1 FSP、MP及硫酸化多糖的安全浓度测定

注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，肩标相同字母或单字母标注表示差异不显著(P>0.05); CC.细胞对照。

Note：In the same column，values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05)，while with the same or single letter superscripts mean no significant difference (P>0.05); CC.Cell control.

表2 FSP和MP多糖对各组细胞OD490 nm值的影响

注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，肩标相同字母或单字母标注表示差异不显著(P>0.05); CC.细胞对照; VC.病毒对照。

表3 先加修饰后多糖对各组细胞OD490 nm值的影响

注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，肩标相同字母或单字母标注表示差异不显著(P>0.05); CC.细胞对照; VC.病毒对照。

FSP、MP及4种修饰后多糖sFSP0.7、sFSP1.9、sMP2.5及sMP1.3组病毒抑制率，依次为20.04%、19.01%、23.67%、20.83%、19.33%、22.47%，其中sFSP0.7组最高，sFSP0.7和sMP1.3高于其他组,修饰前后无明显差异(图1)。

不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母或无字母标注表示差异不显著(P>0.05)

Values with different small letters mean significant difference (P<0.05)，while with the same or no letters mean no significant difference (P>0.05)

图1先加多糖后接种病毒时各组的病毒抑制率

Fig.1 The virus inhibitory rate in different groups after
pre-adding polysaccharides

2.3 先接种病毒后加多糖时NDV感染CEF的能力

检测新疆阿魏多糖、药桑多糖及其硫酸化修饰物对NDV的抑制作用，MP在0.244 μg/mL～3.906 μg/mL、FSP在0.122 μg/mL～0.488 μg/mL、sFSP0.7在0.061 μg/mL～0.977 μg/mL、sMP2.5在0.244 μg/mL～3.906 μg/mL时的A 490值显著大于病毒对照组(VC)(P<0.05)(表2、表4)。FSP、MP及4种修饰后多糖sFSP0.7、sFSP1.9、sMP2.5及sMP1.3组病毒抑制率，依次为26.04%、43.54%、32.50%、43.12%、87.69%、10.77%，其中sMP2.5组增殖率高达87.69%且显著高于其他组。FSP、MP多糖经修饰后抗病毒活性显著增强，尤其是sMP2.5多糖组效果较好(图2)。

2.4 多糖和病毒混合感作后加入时NDV感染CEF的能力

检测新疆阿魏多糖、药桑多糖及其硫酸化修饰物对NDV的直接杀灭作用，MP在0.244 μg/mL～3.906 μg/mL、FSP在1.953 μg/mL～3.906 μg/mL、sFSP0.7在0.977 μg/mL、sFSP1.9除了1.953 μg/mL、sMP2.5除了1.953 μg/mL、sMP2.5在0.031 μg/mL～0.488 μg/mL时的OD490 nm值显著大于病毒对照组(VC)(P<0.05)(表2、表5)。 FSP、MP及4种修饰后多糖sFSP0.7、sFSP1.9、sMP2.5及sMP1.3组病毒抑制率，依次为9.42%、14.55%、10.61%、12.70%、11.32%、20%(图3)。

表4 后加多糖对各组细胞OD490 nm值的影响

注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，肩标相同字母或单字母标注表示差异不显著(P>0.05); CC.细胞对照; VC.病毒对照。

表5 多糖和病毒同时作用对各组细胞A 490值的影响

注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，肩标相同字母或单字母标注表示差异不显著(P>0.05); CC.细胞对照; VC.病毒对照。

不同小写字母表示差异显著(P<0.05),相同字母或单字母标注表示差异不显著(P>0.05)

Values with different small letters mean significant difference (P<0.05),while with the same or on letters mean no significant difference (P>0.05)

图2先接种病毒后加多糖对各组病毒抑制率的影响

Fig.2 Effects of per-inoculating viruses and post-adding
polysaccharides on virus inhibitory rate in different groups

不同小写字母表示差异显著(P<0.05),相同字母表示差异不显著(P>0.05)

values with different small letters mean significant difference (P<0.05),while with the same or on letters mean no significant difference (P>0.05)

图3多糖和病毒混合感作后加入对各组病毒抑制率的影响

Fig.3 Effects of mixed adding polysaccharides with NDV
on virus inhibitory rate in different groups

3 讨论

多糖类是生物体内重要生物大分子，多糖具有抗病毒，调节免疫，抗氧化功能等多种作用[12]。阿得力江等[13]为研究列当多糖抗新城疫病毒活性，通过MTT以3种加药方式(先加多糖后接种病毒、先接种病毒后加多糖、多糖和病毒感作后加)加药，检测列当多糖对新城疫病毒的作用，结果表明，列当总多糖及4种分级多糖均具有抗NDV活性。本试验中的药桑多糖和新疆阿魏也是采取同样的方法检测其对鸡新城疫病毒在鸡成纤维细胞中增殖的抑制作用，实验结果表明新疆阿魏多糖和药桑多糖对在鸡成纤维细胞上感染的鸡新城疫病毒均有一定的抗病毒作用，且药桑多糖的抗NDV作用强于新疆阿魏多糖。

硫酸多糖(sulfated polysaccharide)是一类羟基上带有硫酸根的多糖，多糖的结构修饰对于揭示多糖的构效关系具有重要意义[14]。研究发现多糖经硫酸化修饰后的产物硫酸酯化多糖相比未修饰的多糖，其活性得到了较大的改善。童微等[15]通过体外试验研究发现，硫酸化和脱乙酰化修饰的铁皮石斛多糖能够增强RAW264.7巨噬细胞的免疫活性。宋旭等[16]探讨硫酸化川明参多糖在体外对新城疫病毒的抑制作用，结果表明硫酸化川明参多糖在体外具有显著的抗新城疫病毒的活性，并且高于硫酸肝素。王欢等[17]用氨基磺酸法对党参多糖进行硫酸化修饰，通过MTT法检测了硫酸化修饰前后党参多糖在体外抗Ⅰ型单纯疱疹病毒的作用，研究发现经硫酸化修饰后的党参多糖对Ⅰ型单纯疱疹病毒具有较好的预防及治疗效果。前人研究表明硫酸化修饰可提高多糖的生物活性，但关于新疆阿魏多糖和药桑多糖的硫酸化修饰鲜有报道，本实验对阿魏多糖和药桑多糖及其硫酸产物进行研究，考察硫酸化后是否可提升新疆阿魏和药桑多糖的抗新城疫病毒活性，研究表明一定的修饰可提高药桑多糖和新疆阿魏多糖的抗新城疫病毒活性。

多糖抗病毒机机制可能一是提高机体免疫能力，二是直接作用于病毒。加药方式的不同使新疆阿魏多糖表现出不同的抗病毒活性。先加药物后接种病毒的目的是观察多糖能否进入细胞或吸附于细胞表面，以阻止病毒的吸附与侵入，先接种病毒后加多糖的目的是观察药物能否对已进入细胞内的病毒起作用，抑制其生物合成及成熟释放。病毒和多糖感作后加入细胞的目是观察多糖有无直接杀灭病毒的作用。本文以3种加药方式(先加多糖后接种病毒、先接种病毒后加多糖、多糖和病毒感作后加)加药，考察各多糖对新城疫病毒的阻断作用、抑制作用及直接杀灭作用。先加入多糖组结果显示各多糖均有一定抗新城疫病毒作用，且各组病毒抑制率相差不多，表明各多糖对新城疫病毒有一定的阻断作用；先加入病毒组显示各多糖病毒抑制率均有上升，病毒抑制率有上升趋势，尤其是sMP2.5达到了87.69%，抗病毒作用显著，表明sMP2.5对新城疫病毒具有较强的抑制作用。多糖和病毒混合后加入这种加药方式病毒抑制率没有先加病毒组强。研究表明各多糖对新城疫病毒的阻断作用和抑制作用较好，而直接杀死新城疫病毒作用较弱。与前人研究相似之处为硫酸化多糖可在一定程度提高多糖活性，FSP、MP经硫酸化修饰后抗病毒活性显著增强，尤其是sMP2.5多糖组效果较好，抗新城疫病毒作用最强。经硫酸化修饰我们筛选到了sMP2.5这种具有较好抗病毒作用的硫酸化产物，具有进一步研究的价值。