鱼腥草桔苓合剂的亚慢性毒性试验

吴苑滢，宋漫玲，陈燕晴，何 颖，段群棚，林昌华，蒋家霞，张 宁，郭 旋，胡庭俊*

(1．广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530005；2.广西兽医生物技术重点实验室，广西南宁 530001；3.广西农垦永新畜牧集团新兴有限公司，广西柳州 545112 ；4.广西农垦永新畜牧集团金光有限公司，广西南宁 530022)

鱼腥草是一种“药食两用”的植物，性味寒辛，可清热解毒、利尿、消肿排脓[1]。鱼腥草含有挥发油、有机酸、生物碱、维生素等多种有效成分，能够消炎、抗菌、抗病毒，具有明显促进白细胞和巨噬细胞的吞噬功能而增强机体的免疫力[2-4]。本试验所用的鱼腥草桔苓合剂主要由鱼腥草、桔梗、陈皮、茯苓等中草药组成，中医认为桔梗归肺经而用于宣肺平喘、排脓祛痰，刘琴等[5]复制大鼠肺纤维化模型结果提示，桔梗皂苷D具有抗肺纤维化作用，于维颖等[6]建立哮喘豚鼠模型发现桔梗水提物对呼吸道感染诱发的支气管哮喘有一定作用。茯苓入心、脾、肾经，渗湿利尿，和胃健脾[7]。陈皮理气健脾，燥湿化痰[8]。因此，鱼腥草桔苓合剂主要功效为清肺平喘、止咳祛痰。本试验旨在对鱼腥草桔苓合剂进行长期毒性试验观察，在安全性方面为兽医临床应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试药物 鱼腥草桔苓合剂(中试产品，生产批号1509041)，规格为每1 mL相当于原生药1.025 g，100 mL/瓶，徐州天意动物药业有限公司生产，有效期2年。

1.1.2 仪器及试剂 Aida TD-5A台式低速离心机、纯水仪(CD-UPT-1)，成都纯越科技有限公司产品；AB104-L分析天平，瑞士梅特勒公司产品；UV-1800型紫外可见光分光光度计，北京瑞利分析仪器公司产品；尼康YS100生物显微镜；日本Hitachi-7180全自动生化分析仪，配套试剂为美康生物科技公司；日本Sysmex-2100全自动血液分析仪及其配套试剂等。

1.1.3 实验动物 SPF级SD大鼠，体重90 g～120 g，80只，雌雄各半，购自广西医科大学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK桂2014-0002；饲料为鼠全价饲料，购自广西医科大学实验动物中心；饲养条件为室温22℃～27℃，相对湿度40%～75%。

1.2 方法

1.2.1 试验分组与处理 试验前适应性饲养3 d～5 d，将80只大鼠随机分为4组，即空白对照组、高剂量组(50 mL/kg)、中剂量组(25 mL/kg)和低剂量组(12.5 mL/kg)，每组20只，雌雄各半，分笼饲养。按每只大鼠20 mL/d饮水量，将药物混入饮水中，连续用药30 d。给药结束后，每组随机取雌雄大鼠各5只，眼眶取血，进行血液学检查；分离血清，进行血液生化学检查，主要器官用100 mL/L中性福尔马林固定,用于组织病理学检查。各组剩余动物停止给药，继续饲养观察7 d，再进行剖检。

1.2.2 检测指标 每天观察大鼠的一般健康状况，包括活动、采食、饮水、发病和死亡情况；按每7 d测定大鼠体重1次。用药后30 d及停药后7 d，各组分别随机选大鼠10只，雌雄各半，称重、眼眶采血后颈椎脱臼处死，剖检，采集心、肝、脾、肺、肾、胃、睾丸、卵巢子宫称重，并用100 mL/L中性福尔马林固定。先对高剂量组和对照组大鼠的主要脏器进行组织病理学检查，发现病变后再对较低剂量组大鼠的相应器官及组织进行检查。各组雌雄大鼠各5只采血进行血液学和血液生化指标测定，包括血红蛋白、红细胞计数、白细胞计数、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞的分类计数；丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、尿素(UN)、肌酐(CRE)、血糖(GLU)、白蛋白(ALB)、总蛋白(T-PRO)、总胆固醇(TCH)和甘油三酯(TG)含量。30 d饲喂后于试验结束时测定1次，停药7 d后测定1次。

1.2.3 数据处理 试验数据采用SPSS 21.0软件比较均值-单因素方差分析和多重比较，结果以平均值±标准差表示。

2 结果

2.1 临床观察

给药30 d期间，各组的大鼠精神、行为、活动、毛色、排粪、排尿等一般体征均未见异常，毛色白且有光泽。高剂量组雄性大鼠有1只死亡，死亡前临床症状表现为尾巴出现少量伤口，毛发稍色暗、粗硬。其他大鼠的各项体征均未见异常。

2.2 增重

各给药组，给药30 d后与停药7 d内的平均体重的增长趋势基本相似，与空白对照组比较，第14天至第30天低剂量组的体重增长趋势较为平缓，停药后7 d，各剂量组与空白对照组比较无显著差异(P>0．05)，表明长期给药对大鼠体重无不良影响(图1)。

图1 鱼腥草桔苓合剂对大鼠30 d的平均增重的影响

2.3 血液学指标

给药30 d，各给药组所有血液学指标分别与同期空白对照组比较均无显著差异(P>0.05)；停止给药后7 d恢复期，各给药组的多数指标与空白对照组比较无显著差异(P>0.05)，高剂量组的白细胞、淋巴细胞、单核细胞与空白对照组有显著差异(P<0.05)，说明本品中剂量和低剂量对大鼠血液学指标无显著不良影响(表1和表2)。

2.4 血液生化指标

给药30 d及停药7 d后，各给药组中多数SD大鼠的血液生化指标分别与同期空白对照组比较均无显著差异(P>0.05)。给药30 d后，中剂量组SD大鼠血清中的白蛋白含量显著低于空白对照组(P<0.05)；停药7 d后，高剂量组SD大鼠血清中的白蛋白含量显著低于空白对照组(P<0.05)(表3和表4)。

表1 鱼腥草桔苓合剂用药30 d后大鼠的血液学指标

2.5 脏器指数

给药30 d及停药7 d后，各给药组中多数SD大鼠的脏器指数分别与同期空白对照组比较均无显著性差异(P>0.05)。给药30 d后，低剂量组SD大鼠的脾脏脏器指数极显著高于空白对照组(P<0.01)，低剂量组SD大鼠的肺的脏器指数显著高于空白对照组(P<0.05)；停止给药后7 d，各个剂量组SD大鼠的各脏器指数指标与空白对照组无显著性差异(P>0.05)(表5和表6)。

表2 鱼腥草桔苓合剂停药后7 d大鼠的血液学指标

注：与空白对照组比较，*P<0.05。

Note：Compared with blank control group，*P<0.05.

表3 鱼腥草桔苓合剂用药后30 d大鼠的血清生化指标

注：与空白对照组比较，*P<0.05。

Note：Compared with blank control group，*P<0.05.

表4 鱼腥草桔苓合剂停药后7d大鼠的血清生化指标

注：与空白对照组比较，*P<0.05。

Note：Compared with blank control group，*P<0.05.

表5 鱼腥草桔苓合剂用药后30 d大鼠的脏器指数

注：与空白对照组比较，*P<0.05,**P<0.01。

Note：Compared with blank control group，*P<0.05,**P<0.01.

表6 鱼腥草桔苓合剂停药后7 d大鼠的脏器指数

2.6 病理组织学检查

30 d给药期间高剂量组死亡大鼠剖检可见肺脏色苍白、有大理石样花纹，肝稍肿大。停止给药后，大鼠处死，立即剖检，肉眼逐个观察各脏器，低剂量组1只大鼠脾脏稍肿大；高剂量组个别大鼠肝脏有一白色绿豆大的结节。各组的其他器官无肉眼可见病变。停药7 d恢复期内，高剂量组雄性大鼠死亡1只，经剖检观察，其肺部与背部黏连，肺外观红白相间似大理石样花纹，部分肺叶边缘质地较硬，其他脏器无肉眼可见病变；停药7 d后剖检，高剂量组SD大鼠剖检有个别肝脏见白色小结节；其他脏器均无肉眼可见的病变。

器官切片镜检，高剂量组死亡SD大鼠的肺部充满较多的血细胞，肺组织结构不清晰，肺泡壁增厚；30 d后的SD大鼠脏器在低倍镜和高倍镜下观察，空白对照组的肺脏结构较完整，低、中、高剂量组的少量肺部切片可见肺泡结构不完整且管腔有红细胞细胞浸润、有纤维组织填充在部分肺泡腔里；高剂量组SD大鼠的肝组织切片观察到肝小叶、肝索不清晰，但细胞无明显病变，其他脏器无明显病理变化(图2和图3)。

3 讨论

长期毒性即为实验动物在持续多天里接触较大剂量的外来化合物然后引起的中毒效应，是用于验证在长期持续用药的情况下，药物对用药机体所产生的毒性大小和损害机体的严重程度，还有对机体主要毒性靶器官的影响，为临床用药的剂量要求和主要观察指标提供一定的科学参考[9-10]。根据农业部兽药评审中心《兽药研究技术指导原则汇编》中关于新兽药的安全性评价的技术要求，在获得药物的急性毒性相关资料后，还要进行大鼠30 d喂养试验，观察试验组大鼠的各项生理生化指标，以检验该药物临床使用的安全性。血液生化指标的检测是用于评判肝肾等重要脏器功能是否正常的客观而又灵敏的指标，有时由于溶血，血清中某些指标如AST、LDH、ALP的测定值会显著高于机体真实值，而某些指标的测定值如血糖、胰岛素、总蛋白等会明显低于机体真实值[11]；不同的采血方式也会对血常规和血糖值产生影响[12]，据研究表明静脉血结果比较稳定且准确[13]。

图2 给药30 d后雄性大鼠部分组织切片(HE，400×)

本试验使用的鱼腥草桔苓合剂，主要由鱼腥草、桔梗、陈皮、茯苓等中草药组成，依据清肺化痰，止咳平喘，提高机体非特异性和特异性免疫功能的治疗原则来辨证组方。这些单方药物在《本草》、《别目》、《本草纲目》等文献中均未见有毒性记载，选取的药物安全可靠。本试验将鱼腥草桔苓合剂按高、中、低剂量组50、25、12.5 mL/kg体重对SD大鼠连续30 d进行给药，各剂量组的SD大鼠临床表现良好，未出现可疑中毒症状和毒副作用的相关不良反应，且各剂量组SD大鼠的体重、血液学指标、血液生化指标、脏器指数等各项指标与对照组相比均无显著差异；病理组织学检查各剂量组SD大鼠的心、肝、脾、肾、睾丸(卵巢)等主要靶器官，均未见与药物毒性相关的显著病变；并且在对SD大鼠连续给药30 d、停药7 d后，亦未出现迟发性不良反应。综上试验结果表明，按临床拟用剂量服用鱼腥草桔苓合剂是安全的。

图3 给药30 d后雌性大鼠部分组织切片(HE，400×)

给药期间死亡的1只SD大鼠临床表现为口角和尾巴出现伤口，毛发脏乱、粗硬；由于雄性大鼠的精神状态相对兴奋，伤口可能是互相打架而抓伤较弱小的大鼠；病理剖检只见其肺部稍肿大，色白，与背部黏连；病理切片检查发现肺间隙中仅有少量红细胞充斥在肺泡腔内，其他脏器均为无明显病变。给药结束后，各剂量组的SD大鼠出现个别肺部有类似病变，但该长期毒性试验的靶器官主要为心、肝、肾、脾、胃和睾丸(卵巢)等脏器，并且经临床诊断和病理组织切片检查发现，高、中、低剂量组SD大鼠的心、肝、肾、脾、胃和睾丸(卵巢)等脏器组织与空白对照组相比，基本无明显可见病变。由此推测，该死亡SD大鼠的肺部病变不是由于试验药物毒性引起的，其死亡原因还有待进一步查明。