马立克病病毒感染鸡红细胞6种免疫相关因子转录水平的鉴定

牛 胜，李 欣，张 宁，宁官保，张 鼎，Ali Raza Jahejo,马海利，郝卫芳，高文伟，赵宇军，高诗敏，李桂兰，李建慧，闫 芳，高荣琨，毕玉海，韩凌霞，田文霞*

(1.山西农业大学动物科技学院，山西太谷 030801；2.太原市动物疫病预防控制中心，山西太原 030024；3.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨 150001；4.中国科学院微生物研究所病原微生物与免疫学重点实验室，北京 100101)

马立克病(Marek's disease,MD)是由马立克病病毒(Marek's disease virus,MDV)引起的鸡的一种肿瘤性疾病，每年给养禽业带来巨大的经济损失，多年来人们一直在致力于MD的防控工作，并获得了一定的成效，却并没有解决根本问题。近年来研究表明，机体中红细胞除了参与呼吸循环，同时还参与免疫、代谢等生理过程。目前，关于红细胞免疫的研究主要在人红细胞方面较多，而在有核红细胞方面，主要是关于鱼类和爬行类的红细胞的研究，而关于鸡红细胞的研究则刚刚开始。研究表明，白色念珠菌刺激鳟鱼红细胞后，红细胞增加了细胞因子的表达，从而增强吞噬能力[1]。除此之外，Paolucci等发现红细胞中存在一些Toll样受体(TLR)的组成性表达，并在TLR配体刺激后产生Ⅰ型干扰素(type I interferons，IFNs)和IL-8的诱导表达[2]。前列腺素、细胞外脂肪酸结合蛋白(extracellular fatty acid-binding protein，Ex-FABP)和谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-transferase,GSTs)在炎症和免疫反应过程中发挥至关重要的作用，而环氧化酶-2(cyclooxygenase 2,COX2)、前列腺素E2受体4(prostaglandin E2 receptor 4,PTGER4)、前列腺素还原酶-1(prostaglandin reductase 1,PTGR1)和造血前列腺素D2合成酶(hematopoietic prostaglandin D synthase,HPGDS)参与各前列腺素的表达和调控过程。本课题组前期通过转录组测序筛选了这6种在MDV感染后红细胞中存在差异表达的免疫相关因子，本研究采用双重实时荧光定量PCR检测感染MDV后鸡羽髓中的病毒载量，并通过real-time PCR技术对鸡红细胞中这6种免疫相关因子(COX2、Ex-FABP、GSTA3、PTGER4、PTGR1和HPGDS)的转录水平进行鉴定，以验证红细胞中是否存在表达，并进一步研究在感染MDV后红细胞中这些基因的免疫应答反应，以初步探索在感染MDV后这些免疫相关因子可能的免疫作用。未来需探明这些免疫相关因子在MDV感染过程中的免疫机理，并期望运用此类免疫相关因子来参与马立克病的防治。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物与毒株 马立克病病毒超强毒株MD5、20羽1日龄MHC-B15单倍型SPF鸡，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。

1.1.2 试剂 Trizol(AA909-1)、反转录试剂盒(AK3020)、荧光定量PCR试剂盒(AK6003)，宝生物工程(大连)有限公司产品；PBS(phosphate buffered saline)，北京Solarbio科技有限公司产品；pMD-O 和pMD-M质粒，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 马立克病病毒感染试验 1日龄B15单倍型SPF鸡20羽，分为攻毒组和对照组(每组各10羽)。饲养至4日龄后，将攻毒组每只鸡腹腔注射MD5血毒500 PFU(0.5 mL)，对照组注射相同体积的PBS缓冲液。在接毒后第4、7、9、14天分别从两组鸡中各收集4～5根羽毛，保存于液氮中。并在接毒后第14天和第22天每组随机选取3只鸡进行心脏采集抗凝血(2 mL/羽)，分离红细胞。

1.2.2 检测SPF鸡羽髓中MDV载量 将收集的羽毛通过常规酚-氯仿法提取羽髓中DNA[3]，并测定DNA浓度及纯度，稀释至100 ng/μL，因超强毒株MD5 Ⅰ型血清具有特有基因meq，因此以此基因为检测病毒的目的基因，以鸡卵铁转蛋白(ovo)为内参基因，建立双重实时荧光定量PCR方法，并以此检测攻毒后羽髓中病毒拷贝数，其中meq基因及ovo基因的荧光素标记探针和引物序列参照文献合成[4]，具体见表1。通过双重实时荧光定量PCR绘制标准曲线及检测病毒拷贝数，具体操作见参考文献[4]。

1.2.3 红细胞总RNA提取与反转录 用Trizol法提取红细胞总RNA，对提取的RNA分别用琼脂糖凝胶电泳和核酸测定仪进行质量和浓度检测。根据反转录试剂盒操作步骤，将合格的RNA反转录为cDNA，用于后续的real-time PCR试验。

1.2.4 Real-time PCR检测各基因转录表达水平 根据NCBI中目的基因mRNA序列设计引物，由上海捷瑞公司合成，引物序列见表2，后通过real-time PCR技术对各基因COX2、Ex-FABP、GSTA3、PTGER4、PTGR1、HPGDS的mRNA表达水平进行检测。18S rRNA作为内参基因，每个样本设4个重复，反应体系及操作步骤参考文献进行[5]。

表1 双重实时荧光定量PCR的引物及探针信息

表2 定量PCR引物信息

1.2.5 数据分析 以第14天对照组为参照，使用2-△△Ct法计算目的基因在各组中的相对表达量，并用SPSS Statistics 17.0软件进行差异显著性分析。显著性用不同字母表示(a～d)。

2 结果

2.1 感染MDV后羽髓中病毒载量变化

通过双重实时荧光定量PCR分别对感染MDV后第4、7、9和14天的羽髓中病毒载量进行检测，结果显示在对照组中没有检测到MDV拷贝；在攻毒组中第7天后检测到MDV的拷贝，并且在第14天检测到的MDV拷贝数显著高于其他检测时间(图1)。

a表示差异显著(P<0.05)a=significant differences (P<0.05)

2.2 感染MDV后鸡红细胞中各基因的mRNA表达变化

Real-time PCR结果显示，MDV感染后第14天，与对照组相比，攻毒组COX2的表达显著上调(P<0.05)，而在第22天COX2的表达整体高于第14天(P<0.05)；在第14天和第22天，PTGER4、HPGDS和GSTA3在攻毒组中的表达量显著低于对照组(P<0.05)；与之相反，在第14天和第22天，PTGR1在攻毒组中的表达量显著高于对照组(P<0.05)；第14天攻毒组的Ex-FABP表达水平显著低于对照组，而在第22天攻毒组表达量显著高于对照组(P<0.05)(图2)。

3 讨论

近年来发现，红细胞除了作为运输氧气和二氧化碳的主要载体，还具有识别、粘附、杀伤抗原和清除免疫复合物等免疫调控功能。Morera[6]对虹鳟鱼和鸡的转录组进行了分析，提示红细胞在免疫应答方面发挥一定作用。本研究结果显示，鸡红细胞中存在六种免疫相关基因COX2、Ex-FABP、GSTA3、PTGER4、PTGR1和HPGDS的转录表达，这表明这些基因的表达可能参与红细胞的免疫调节作用。

a～d表示差异性(P<0.05)

Lowercase letters (a-d) indicate statistically significant differences (P<0.05)

图2 COX2、PTGER4、PTGR1、HPGDS、GSTA3和
Ex-FABP的mRNA表达变化

Fig.2 Expression changes of COX2,Ex-FABP,GSTA3,PTGER4,
PTGR1 and HPGDS in erythrocyte of MD5

本试验结果显示，感染MDV后鸡羽髓中病毒拷贝数在第14天显著升高，这表明在第14天病毒在体内大量增殖，可能从此阶段开始造成对机体严重的损伤和感染。近年来研究显示，前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)的合成异常与多种疾病密切相关，特别是促进肿瘤的发生发展[7-8]。COX是前列腺素合成过程中的关键酶。COX分为两种COX1和COX2，COX1主要调节正常的生理过程，而COX2被认为广泛地参与炎症反应[9]。有研究表明，COX2参与肿瘤发生发展，具有促血管生成，促进肿瘤细胞增殖与转移的作用，并与肿瘤细胞的凋亡抵抗等密切相关[10-11]。COX2药理性或遗传性的失活会抑制肿瘤细胞的生长和存活，同时抑制肿瘤的生长、侵袭和转移[12]。有试验发现，在多种肿瘤中都检测到了COX2和PGE2的高表达，这种高表达与肿瘤的发展密切相关[13]。从本试验结果可以发现，与第14天对照组相比，红细胞中COX2的mRNA水平在第14天攻毒组中显著上调，而在第22天对照组与攻毒组表达水平整体显著上调，这表明在此阶段，随着病毒在体内大量增殖与感染，红细胞也通过COX2基因上调表达引起PGE2的合成增加，从而参与机体的免疫调节作用，这一结果可能与淋巴瘤细胞增殖有关。

HPGDS是催化PGD2生成的一类关键酶，也是Σ类谷胱甘肽S-转移酶家族之一[14-15]。 GSTs是一类具有多种生物功能的酶[16]，GSTs酶活性的改变可引起正常细胞代谢的改变，使得机体正常细胞对毒害物质的清除能力下降[17]，抗氧化机能减弱甚至丧失，对疾病尤其是肿瘤的易感性增强[18]。real-time PCR结果显示，分别在第14天和第22天，攻毒组HPGDS和GSTA3的mRNA表达量持续下调，这表明机体在感染病毒后，HPGDS在感染MDV之后表达受到抑制，从而抑制PED2的表达。随着免疫抑制及红细胞中GSTA3的表达降低，导致机体抗氧化能力减弱，利于肿瘤细胞的活化、增殖及转移。

Ex-FABP参与炎症性疾病，能够随着炎性因子增加而表达量上升[19]，在鸡胚肝脏受到炎性因子脂多糖刺激后，Ex-FABP表达量增强[20]。Ex-FABP是一种急性期蛋白，在病理性的应激条件(如退化性疾病、肿瘤等)下能激活该蛋白的表达[21]。在本试验中发现，攻毒组红细胞中Ex-FABP的mRNA水平在第14天表达量下调，而在第22天表达量上调极显著，这表明在MDV大量增殖初期Ex-FABP的表达受到明显抑制，而随着进一步感染加剧，Ex-FABP表达急剧升高以作为抵抗肿瘤恶化的一类效应分子。

PGE2的受体分为4种亚型，分别为PTGER1、PTGER2、PTGER3、PTGER4。近年来有研究显示，在肿瘤细胞侵袭过程中，PTGER4参与了其迁移过程[22]，已有证据表明COX-PGES-PGE2-PTGER信号传导通路与多种肿瘤的发生相关[23-24]，Brouxhon等人发现在紫外线诱导发生的皮肤肿瘤中，敲除PTGER4基因可增强了肿瘤的转移[25]。本研究发现，在鸡感染MDV后第14天和22天，红细胞中PTGER4的mRNA表达量显著下调，这说明机体红细胞在病毒大量增殖初期做出了一定的调控以减少PTGER4的表达，并抑制COX-PGES-PGE2-PTGER信号通路，从而抑制淋巴肿瘤转移及恶化。随着疾病的发展，PTGER4的表达量逐渐上升，机体抑制淋巴肿瘤转移的能力逐渐降低。

PTGR1参与炎症和抗氧化反应，能够参与类花生酸代谢，如PGE2、15-脱氢-△-12,14-前列腺素J2和前列腺素A4[26]。有研究发现，在体外的肝癌细胞样品中，整个肿瘤细胞发展阶段，PTGR1基因一直处于过表达的状态，这种高表达，有助于癌细胞的增殖及提高肿瘤细胞的转移功能[27]。本试验中，在第14天及22天的攻毒组红细胞中PTGR1的mRNA水平显著上调，这说明感染后红细胞中PTGR1的上调表达可能是淋巴肿瘤的发生引起的，这与之前的肿瘤相关研究结果相一致。

综上所述，鸡红细胞中存在COX2、Ex-FABP、GSTA3、PTGER4、PTGR1和HPGDS共6种免疫相关基因的转录表达。在感染MDV后第14天羽髓中病毒增殖显著升高，同时证明红细胞中这6种基因在MDV感染后都有显著的免疫应答，并且红细胞可通过调控前列腺素代谢对MDV感染过程发挥了一定的免疫调控作用。