新型竹鼠源阿卡斑病毒RT-PCR检测方法的建立

唐海波，彭可可，陈凤莲，白安斌，刘金凤，吴健敏*

(1．广西兽医研究所，广西南宁 530001；2.广西兽医生物技术重点实验室，广西南宁 530001；3．广西中医药大学，广西南宁 530001；4.广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530004)

阿卡斑病(Akabane disease)又名赤羽病，是由阿卡斑病毒 (Akabane virus,AKAV) 引起的，以昆虫为传播媒介的一种牛、羊重要病毒性传染病，可引起牛、绵羊和山羊流产、早产、死胎、胎儿畸形、木乃伊胎及新生儿关节弯曲和积水性无脑症及脑炎等。该病于20世纪30年代在澳大利亚的牛、羊群中流行，随后日本亦有报道。1972年-1973年，在日本关东以西的牛群中暴发，损失犊牛5万头以上[1-2]。除日本、澳大利亚以外，以色列、沙特阿拉伯、科威特、也门、巴林、土耳其、印度尼西亚、韩国和阿拉伯联合酋长国等国或地区相继报道本病[3-8]。阿卡斑病给畜牧业造成严重的经济损失，对养牛、养羊业的发展构成巨大威胁，已引起普遍重视，是国际动物贸易重点检疫对象。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病，我国《进境动物一、二类传染病、寄生虫病名录》将其列为二类动物疫病，是我国从国外进口牛、羊必检的疫病之一。

新型竹鼠源阿卡斑病是国内外首次报道的在自然环境下引起大规模的成年竹鼠死亡的病例。迄今，国内外没有任何关于该病毒的基因参考序列。2013年11月～12月广西柳州三江、2014年4月～5月广西桂林及2016年6月～8月广西柳城3个不同地区县市先后分别在人工养殖的竹鼠群中暴发一种怪病。据不完全统计，有11个竹鼠养殖场(三江3个场，桂林5个场，柳城3个场)共计3万多只竹鼠受影响。该病临床特征是在单侧或双侧后腿麻痹、拖行，颤抖、转圈、幼年竹鼠出现神经症状，抽搐、四肢僵直，口鼻、耳朵、眼眶、前后肢等少毛或无毛的部位皮肤出现红疹，部分足掌龟裂。发病竹鼠，食欲下降或不食，出现症状后1 d～3 d内发生死亡。因其都表现出后腿拖行现象，且为烈性发病，在广西俗称为 “拖垃圾病”。剖检可见大脑充血、出血，肺有出血点、出血斑，肝质脆、色浅，脾肿大、部分梗死，肾有出血点。幼年和成年竹鼠均发病，发病率20%～30%，但死亡率几乎100%[9]。流行病学调查发现，竹鼠养殖场之间存在相互引种外，大多数发病场之间无明显其他联系。细菌分离结果显示除大肠埃希菌外，未见其他有意义的致病菌。RT-PCR或PCR 检测痘病毒、疱疹病毒、腺病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、狂犬病病毒、仙台病毒常见大鼠病毒均为阴性。经本课题组诊断排除了其他细菌和病毒病，通过病毒宏基因组学、RT-PCR 扩增和细胞分离培养证实该病为AKAV感染。研究结果发现该毒株对竹鼠属于强毒力。

随着我国特种动物养殖业的迅速发展，竹鼠养殖业得以不断壮大，而目前国内外在新型竹鼠源阿卡斑病毒性疾病领域的研究和报道还处于空白状态，没有任何参考文献和序列报道，临床上针对新型竹鼠源AKAV病的防治处于空白状态。因此，急需一种快速检测新型竹鼠源AKAV病的方法，来对发病竹鼠进行及时诊治。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒与阳性病料组织 新型竹鼠源AKAV Vero细胞培养液由本实验室分离并保存，用于提取RNA的新型竹鼠源AKAV滴度为106.33TCID50/0.1 mL。竹鼠细小病毒由广西壮族自治区兽医研究所分离并保存、竹鼠内源性反转录病毒、竹鼠圆环病毒及竹鼠乳酸脱氢酶增高病毒阳性竹鼠组织样品由广西壮族自治区兽医研究所实验室保存。

1.1.2 主要试剂 AXYGEN体液病毒DNA/RNA小量试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；2×EsTaqMasterMix 购自天根生化科技(北京)有限公司；DNA Marker DL 2 000、pMD-18T 购自TaKaRa公司。

1.1.3 实验动物 12 只70日龄的健康银星竹鼠购自南宁市金诚双丰农牧科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 AKAV竹鼠颅内接种致病试验及组织样品收集 将12只70日龄的健康银星竹鼠随机分成2组，每组6只，第1组每只通过颅内注射0.05 mL，病毒滴度为106.33TCID50/0.1 mL的Vero细胞培养液；第2组每只颅内注射等量DMEM。注射后连续观察记录竹鼠发病死亡情况，并及时收集濒死竹鼠无菌剖解，肉眼观察大体病理损伤，取脑、心、肝、脾、肺、肾，进行发病竹鼠不同组织器官病毒核酸丰度测定。

1.2.2 引物的设计与合成 分别扩增2013年三江分离的1株竹鼠源AKAV的S基因和2016年柳城分离的5株病毒的全基因序列。测序结果已上传GenBank，获得登录号分别为KY385908和KY381272-KY381286。根据测序结果得到的新型AKAV糖蛋白M基因序列的保守区域，用DNAstar、oligo6.0、 NCBI-blast等生物学软件的综合分析设计引物，包括一对位于核蛋白S基因的引物AKVS1和AKVS2，一对位于糖蛋白M基因的引物AKVM1和AKVM2(表1)，引物由深圳华大基因科技有限公司合成，用DEPC 处理水溶解，置-20℃保存。

表1 RT-PCR引物信息

1.2.3 竹鼠组织样品处理及RNA模板的制备 均匀剪取性竹鼠病料组织的脑、心、肝、脾、肺、肾等组织与抽滤除菌DMEM按体积比1∶5的比例研磨制成病料悬液，分装到1.5 mL EP管内，经3次冻融后，将病料悬液8 000 r/min 4℃离心5 min，取上清200 μL，同时等量吸取阳性病毒液与阴性对照。按照AXYGEN体液病毒DNA/RNA小量试剂盒操作说明提取模板RNA，产物直接用于RT-PCR反应或置于-80℃保存。

1.2.4 RT-PCR 引物及引物浓度初步筛选 按1.2.3方法抽提得到的AKAV阳性样品总RNA，用Oligo(dT)18作为下游引物进行反转录得到cDNA,以cDNA为模板,使用2×EsTaqMaster Mix进行PCR 扩增。在反应体系设为25 μL，引物浓度为20 μmol/L，PCR反应程序：94℃ 4 min，94℃ 30 s，60℃ 45 s，72℃ 1 min，共进行35个循环；72℃ 5 min。首先对设计的两对引物进行初步筛选。反应结束后，取PCR产物5 μL经10 g/L琼脂糖凝胶电泳进行鉴定以确定引物是否可以进一步优化。进一步在引物浓度为20 μmol/L的情况下，设置10 μL～50 μL反应体系进行PCR以确定最佳反应体系。最后在反应体系不变的情况，设置不同的引物浓度进行PCR，筛选最合适的引物浓度。

1.2.5 RT-PCR 退火温度的确定 在其他反应成分和反应条件不变的情况下对退火温度进行优化，PCR反应程序：94℃ 4 min，94℃ 30 s，53℃、57℃、60℃ 45 s，72℃ 1 min，共进行35个循环；72℃ 5 min。反应结束后，取PCR产物5 μL经1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定以确定最佳退火温度。

1.2.6 RT-PCR方法特异性与敏感性分析 分别提取新型竹鼠源AKAV、竹鼠圆环病毒、竹鼠细小病毒、竹鼠内源性反转录病毒、竹鼠乳酸脱氢酶增高病毒核酸。按1.2.5确定的反应液体系及退火温度，对本RT-PCR 方法进行特异性试验。用蛋白质核酸测定仪测定模板cDNA初始浓度为23 ng/μL，然后对模板cDNA进行10倍倍比稀释后进行PCR，35个PCR循环后，检测该方法的敏感性。

2 结果

2.1 RT-PCR 引物初步筛选与退火温度确定

分别用引物AKVS1 和AKVS2及AKVM1和AKVM2扩增新型竹鼠源AKAV阳性样品，初步筛选引物的特异性及稳定性，结果发现，即使在60℃的退火温度下，引物AKVS1和AKVS2也能扩增出非特异目的条带，且非特异条带非常明显，已影响结果判定，故被淘汰。经过一系列优化，确定了RT-PCR方法的反应体系(25 μL)为：AKVM1和AKVM2浓度为20 μmol/L各0.5 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 9.5 μL,2×EsTaqMaster Mix 12.5 μL。

用反转录好的样品cDNA作为模板，设置不同的退火温度，其他条件均设置成相同的情况下进行PCR，结果显示，退火温度从53℃～60℃，目的基因片段都能获得较高的扩增的产量，目的片段大小为816 bp，其中以53 ℃退火时，产量最高，随着退火温度的升高，PCR扩增目的基因片段产量稍有降低(图1)，但都能明显满足普通PCR检测方法的观察判断要求。最终确定本检测方法的退火温度设为57℃。

M.DNA 标准DL 2 000; 1.53℃; 2.57℃; 3.60℃; 4.ddH2O

M.DNA Marker DL 2 000; 1.53℃; 2.57℃; 3.60℃; 4.ddH2O

图1 RT-PCR检测方法退火温度优化结果

Fig.1 Optimization of annealing temperature of the RT-PCR

2.2 RT-PCR 方法的特异性

RT-PCR特异性扩增结果显示，仅竹鼠源AKAV能扩增出特异性目的条带，其他病毒不能扩增出目的条带(图2)。表明本检测方法具有很高的特异性。

2.3 RT-PCR 方法的敏感性

结果见图3，最终测定该方法的最低检测量为23 pg，说明本研究建立的RT-PCR方法具有良好的敏感性。

M.DNA标准DL 2 000; 1.新型竹鼠源阿卡斑病毒; 2.ddH2O; 3.竹鼠内源性反转录病毒; 4.竹鼠圆环病毒; 5.竹鼠细小病毒; 6.竹鼠乳酸脱氢酶增高病毒

M.DNA Marker DL 2 000; 1.The novel AKAV isolated from bamboo rat; 2.ddH2O; 3.Bamboo rat endogenous retrovirus; 4.Bamboo rat circovirus; 5.Bamboo rat parvovirus; 6.Bamboo rat lactate dehydrogenase-elevating virus

图2 RT-PCR检测方法特异性试验

Fig.2 Specificity test of the RT-PCR

M.DNA 标准DL 2 000; 1～5.cDNA浓度分别为23 ng/μL，2.3 ng/μL，230 pg/μL，23 pg/μL，2.3 pg/μL

M.DNA Marker DL 2 000; 1-5.The concentrations of cDNA 23 ng/μL，2.3 ng/μL，230 pg/μL，23 pg/μL，2.3 pg/μL,respectively

图3 RT-PCR检测方法敏感性试验

Fig.3 Sensitivity test of the RT-PCR

2.4 RT-PCR方法检测AKAV感染发病竹鼠样品

用Vero细胞分离培养的新型竹鼠源AKAV颅内接种感染6只70日龄的竹鼠，待感染组开始发病时，进行解剖并采集样品用优化过的RT-PCR检测。结果显示，攻毒后发病的竹鼠脑、心、肝、脾、肺、肾组织样品均能扩增出816 bp的特异性目的条带，并对目的条带进行了克隆测序，对比发现目的条带为竹鼠源AKAV M基因，且与原病毒有100%的同源性(图4)。

3 讨论

我国从20世纪90 年代初发现本病流行，李其平等研究发现我国上海、广州、福建等地各牛场常发现有不明原因的流产、早产、死胎、新生胎儿关节弯曲及积水性无脑症等。1997年上海地区部分奶牛场再次暴发了以妊娠母牛异常流产为典型特征的一种传染病,异常流产率在10%～15%,流产胎儿以死胎、畸形胎居多,关节弯曲，并首次从上海采集的蚊和库蠓中分离到AKAV[10]。近年来，云南从蚊虫中分离到2株AKAV[11-12]。本课题组前期对采集自广西11个市的牛羊血清进行AKAV抗体检测，共检测血清706份，检测结果显示广西牛、羊畜群AKAV的总感染率为54.11%[13]。2016年本课题组首次从广西柳城、三江等地大量发病死亡的竹鼠脑组织中分离到5株AKAV，确认了我国家畜中有本病流行。

M.DNA标准DL 2 000; 1.两只感染发病竹鼠的肾; 2.肺; 3.脾; 4.肝; 5.心; 6.脑; C1.正常竹鼠脑组织对照；C2.ddH2O

M.DNA Marker DL 2 000; 1.Kidney; 2.Lung; 3.Spleen; 4.Liver; 5.Heart; 6.Brain; C1:The uninfected control bamboo rat′s brain; C2:ddH2O

图4 RT-PCR检测方法的临床检测

Fig.4 Test of bamboo rat samples with the RT-PCR

迄今，竹鼠源AKAV是目前第一次报道的在自然环境下引起大规模的成年竹鼠死亡的病例。全基因测序发现，竹鼠源阿卡斑病毒是一种新型AKAV。基于S基因遗传进化树显示，竹鼠源AKAV与中国境内牛源AKAV亲缘关系最近，同源性为99.2%。然而,基于M基因遗传进化树显示，竹鼠源AKAV却与中国境内牛源AKAV处于不同的进化分支上，且同源性仅为91.8%。相比之下，竹鼠源AKAV M基因与来自韩国、日本的强毒株同源性高达97.7%。遗传进化树也处于相同的分支。换句话说，竹鼠源AKAV S基因具有中国牛源AKAV的遗传特征，但是M、L基因却有着韩国、日本牛源强致病性毒株的遗传特征[9]。该病毒对成年小鼠及竹鼠具有强致病性，对牛羊是否具有强致病性目前还未知，同时该病在我国的流行状况仍不甚明朗，今后仍需广泛开展畜间疫情监测尤其是病原学，包括不同家畜样本的病毒分离和序列测定分析，同时开展蚊虫媒介及其携带病毒调查，以掌握本病在我国的分布状况、主要流行毒株和临床特点，为防控工作提供科学依据。

本研究建立了一种快速检测新型竹鼠源AKAV的RT-PCR方法，可在3 h内完成扩增。同时，本方法具有较高的敏感性，可达23 pg。而特异性试验显示，本研究建立的RT-PCR方法具有很高的特异性。基于竹鼠源AKAV是一种新发现的病毒，目前国际上还没有关于竹鼠源AKAV的报道。本方法的建立将填补相关技术上的空白，适用于田间、养殖场及口岸等大量样品的初检。为AKAV的防控提供技术储备。对攻毒发病的竹鼠，采集其脑及内脏组织器官样品，统一处理后进行RT-PCR检测。可判定发病竹鼠不同组织病毒核酸丰度，其中以脑组织的含量最高，肝脏的病毒含量最低(图4)，RT-PCR产物测序分析也显示，其序列与攻毒新型竹鼠源AKAV 100%同源。总之，本研究建立的检测方法准确可靠，解决了临床检测需求，为制定AKAV防控对策提供技术支撑和科学依据，对保障我区乃至全国牛、羊及竹鼠产业的健康发展具有十分重要的意义。