乙酰丙酸-十二烷基硫酸钠对结核分枝杆菌的杀灭作用及其安全性毒理学评价

吕霞丽 李自慧 潘丽萍 贾红彦 张宗德 刘 洋

(首都医科大学附属北京胸科医院 北京市结核病胸部肿瘤研究所 耐药结核病研究北京市重点实验室，北京 101149)

结核分枝杆菌是引起结核病的病原菌，严重威胁着人类的健康，切断结核分枝杆菌传播途径是控制结核病传播的重要措施之一。目前常用的结核分枝杆菌消毒剂有含碘类、含氯类、含醛类、过氧化物类等。这些消毒剂对结核分枝杆菌都有一定的杀灭作用但也均存在不同的不良反应。如含碘类消毒剂会导致过敏[1]，甚至会引起甲状腺疾病[2]等严重后果。含氯类消毒剂对人体皮肤黏膜造成损害，如高浓度的84消毒液(次氯酸钠)可致使皮肤发白、水肿发炎、水疱，致使眼部疼痛、流泪、溃疡等[3]；84消毒液对操作台面和金属器械存在腐蚀性[4]。含醛类消毒剂有强刺激性、毒性和腐蚀性，甚至能引起过敏和哮喘[5]。过氧化物类消毒剂易分解、刺激性强，可引起DNA损伤、基因突变、致癌等[6]。因此，迫切需要更为安全有效的消毒剂切断结核分枝杆菌的扩散传播。

乙酰丙酸-十二烷基硫酸钠(levulinic acid，sodium dodecyl sulfate，LVA-SDS)是一种广谱的，杀灭作用较强的新型消毒剂[7-8]。LVA主要生产原料是含纤维素的可再生原料(比如高粱[9]等)，因此不仅成本低、产量高，而且无害无污染。经过美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration，FDA)认证和批准[10]，LVA可以加入到化妆品、调味剂、烟草等食品或者日常用品中，具有很好的安全性。SDS也是FDA认证的多功能添加剂，是一种活性添加剂，已经广泛用于日常生活中，比如添加到蛋清、果汁、植物油和明胶中等[11]，其安全性也得到了认可。可见LVA-SDS确实具有安全性好等优点，且对大肠杆菌、沙门菌、人类诺瓦克病毒等多种微生物均有较好的杀灭作用，但国内对结核分枝杆菌的杀灭作用的研究报道较少。因此，本研究将LVA和SDS简单混合后，初步探讨对结核分枝杆菌标准株H37Rv和耐多药结核分枝杆菌临床分离株的杀灭作用，并对其在实际应用时的安全性进行评价。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1)菌株：结核分枝杆菌标准株H37Rv(ATCC_27294)，耐多药结核分枝杆菌临床分离株(同时对利福平、异烟肼耐药，临床药敏编号2202)，均来自首都医科大学附属北京胸科医院国家结核病临床实验室菌株库。

2)消毒剂：纯度98%，密度1.134 g/mL的乙酰丙酸(Acros Organics公司, 美国)(按体积分数配制所需的不同浓度溶液)，十二烷基硫酸钠(北京鼎国生物技术有限责任公司)(按质量分数配制所需的不同浓度溶液)，两者具体配比参考文献[9]；有效氯含量为1 000 mg/L的次氯酸钠(北京洗得宝消毒制品有限公司)，商用名“84消毒液”(按质量分数配制)。

3)中和剂：LVA-SDS中和剂[7]为0.1 mol/L PBS溶液，次氯酸钠中和剂[12-13]为5 g/L硫代硫酸钠、3 g/L卵磷脂、10 g/L吐温-80的PBS溶液。

4)有机干扰物：3%(体积分数)牛血清白蛋白(BSA)。

5)试验动物：SPF级BALB/c小鼠，体质量18～20 g，采用区组随机化分组，雌雄各半，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物许可证号：SYSK(京)2015-0007。该动物实验经过医院伦理委员会批准(批准文号：2017-6)。

1.2 悬液定量杀菌试验[13]

1)菌悬液制备：在无菌磨菌瓶中加入1～2滴10%(体积分数)吐温-80水溶液，用无菌吸管尖端或无菌接种环刮取2～3周改良罗氏培养基处于对数生长期的新鲜菌落，置于磨菌瓶中。之后旋紧瓶盖在涡旋振荡器上振荡30～60 s。静置10 min后，打开瓶盖，加入约2 mL无菌0.9%(质量分数)氯化钠注射液，轻轻晃动后静置片刻，使菌液中的大块物质沉淀。用无菌吸管吸取中上部的菌液约1 mL，转移至另一无菌试管中，与麦氏比浊管比浊。逐渐滴加无菌0.9%(质量分数)氯化钠注射液，直至菌液浊度与标准麦氏比浊管一致，即得到1 mg/mL的菌悬液，备用。

2)中和剂鉴定试验：具体操作详见2002年版《消毒技术规范》[13]规定的中和剂试验方法，现简述如下：设置平行6组实验，按照悬液定量杀菌试验程序进行。①消毒剂+菌悬液；②(消毒剂+菌悬液)+中和剂；③中和剂+菌悬液；④(消毒剂+中和剂)+菌悬液；⑤稀释液+菌悬液(正常菌阳性对照)；⑥稀释液+中和剂+培养基(阴性对照)。其中稀释液为去离子水；②组和④组区别在于：④组消毒剂与中和剂先接触，终止消毒剂的杀灭效能；而②组消毒剂与菌悬液先接触，之后使用中和剂，主要用于控制消毒剂的杀灭时间。消毒剂与细菌悬液作用5 min，试验在常温下进行。试验重复3次(每次3个重复，共做了3次)均符合2002年版《消毒技术规范》的中和剂评定标准时，表明所选中和剂及其浓度适宜。

3)悬液定量杀菌试验：在无菌试管内加入0.5 mL菌悬液和0.5 mL有机干扰物[3%(体积分数)BAS]，置于(20±1)℃水浴中备用。加入4 mL倍比稀释的LVA-SDS消毒剂[阳性对照为0.9%(质量分数)氯化钠注射液，阴性对照为1 000 mg/L含氯消毒剂]，立即混匀。作用5、15、30 min后，取0.5 mL混合液加入4.5 mL中和剂，混合中和作用10 min。取0.1 mL混合液置于7H10固体培养基上，用L棒涂抹均匀，37 ℃恒温箱中培养1个月，观察结果并记录菌落总数(CFU/mL)，计算平均杀灭对数值(N)。所有试验均重复3次。按照下列公式计算平均杀灭对数值：平均杀灭对数值(N)=对照组平均活菌浓度的对数值(No)-试验组活菌浓度的对数值(Nx)。

1.3 消毒剂的安全性毒理学评价试验[13]

1)急性经口毒性试验：本实验选用该方法用于评价消毒剂的急性毒性反应。采用一次最大限度试验法。选用SPF级BALB/c小鼠12只，每组6只，雌雄各半。试验前小鼠隔夜禁食12 h，不禁水。参照2002年版《消毒技术规范》，采用灌胃方式，按照0.4 mL·20 g-1给予受试液[20%(体积分数)LVA+2%(质量分数)SDS]，用灌胃针头将受试液经口一次给予动物，连续观察14 d，观察并记录动物中毒的表现和死亡情况，计算LD50(采用累积法计算LD50)。试验结束后，处死存活动物，进行解剖，肉眼观察是否出现组织和脏器异常。

2)蓄积毒性试验：本实验选用该方法用于评价消毒剂的慢性毒性反应。选用SPF级BALB/c小鼠12只，每组6只，雌雄各半。试验前小鼠隔夜禁食12 h，不禁水。采用灌胃方式，每天灌胃一次，按照0.4 mL·20 g-1计算染毒量，每4天为一期。第一期剂量为0.1 LD50，以后每期的剂量按照《消毒技术规范》中定期递增染毒剂量用表中所示递增，直至半数动物死亡为止，计算累积总剂量即为LD50(n)。如果给药28天，死亡动物仍不足半数，即停止实验。蓄积系数(K)公式：K=LD50(n)/LD50，计算并确定蓄积毒性分级。

3)皮肤刺激试验：本实验选用该方法用于评价消毒剂对皮肤是否存在刺激性。选用SPF级BALB/c小鼠6只，雌雄各半。试验前24 h观察小鼠耳缘皮肤是否完好，无破损，次日将消毒液(20%LVA+2%SDS)直接涂抹于一侧完整的皮肤上，另一侧作为空白对照。分别于1、24、48 h后观察皮肤的局部反应，根据有无红斑和水肿形成，进行皮肤反应刺激评分。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 中和剂鉴定试验

第1组无菌落生长。第2组有菌落生长，较第1组为多，但较第3、4、5组为少。第3、4、5组，组间菌落数在1×107～5×107CFU/mL，误差率不超过15%。第6组无菌落生长，详见表1。结果表明，0.1 mol/L PBS溶液可以有效中和浓度20%(体积分数)LVA、20%(体积分数)LVA+2%(质量分数)SDS的消毒剂对结核分枝杆菌标准菌株H37Rv和耐多药结核分枝杆菌临床分离株的残留作用，且中和剂及其产物对试验菌生长和培养基无不良影响，符合有效中和剂结果判定要求。5 g/L硫代硫酸钠、3 g/L卵磷脂、10 g/L吐温-80的PBS溶液均可以有效中和浓度为1 000 mg/L的次氯酸钠，符合有效中和剂结果判定要求。

2.2 悬液定量杀菌试验结果

统计学分析结果显示，20%(体积分数)LVA和20%(体积分数)LVA+2% (质量分数)SDS作用30min对菌悬液内结核分枝杆菌标准株H37Rv的杀灭对数值(5.03 ±0.17vs5.53 ±0.38)比较，差异有统计学意义(P<0.001)；20%LVA 及20%LVA+2%SDS和1 000mg/L次氯酸钠(6.20 ±0.00)的杀灭对数值比较，差异均有统计学意义(P<0.001)，详见表2。

表1 含氯消毒剂、LVA和LVA-SDS消毒剂的中和剂鉴定试验结果Tab.1 Neutralizer qualification test results for chlorine-containing disinfectants, LVA, and LVA-SDS disinfectants

LVA：levulinic acid；SDS：sodium dodecyl sulfate.

20%(体积分数)LVA和20%(体积分数)LVA+2% (质量指数)SDS作用30min对菌悬液内耐多药结核分枝杆菌临床分离株的杀灭对数值(5.03 ±0.15vs5.12± 0.06)比较，差异有统计学意义(P<0.05)；20%(体积分数)LVA 及20%(体积分数)LVA+2%(质量分数)SDS和1 000mg/L次氯酸钠杀灭对数值(6.17 ±0.00)比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；详见表3。含有效氯1 000mg/L的“84消毒液”对结核分枝杆菌的杀灭作用强于20%(体积分数)LVA和20%(体积分数)LVA+2% (质量分数)SDS。

表2 LVA-SDS在不同浓度、时间条件下对结核分枝杆菌标准株H37Rv的杀灭作用Tab.2 Killing effect of LVA-SDS on Mycobacterium tuberculosis standard strain H37Rv at different concentrations and times

表3 LVA-SDS在不同浓度、时间条件下对耐多药结核分枝杆菌临床分离株的杀灭作用Tab.3 Killing effect of LVA-SDS on clinical isolates of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis at different concentrations and times

2.3 LVA-SDS的安全性毒理学试验结果

1)急性经口毒性试验：结果为LD50>5 000 mg/kg，参照《消毒技术规范》[13]中的毒性评价可知，该消毒剂属实际无毒级。试验期间实验动物未出现异常，无死亡。实验结束后，解剖处死的实验动物，肉眼观察未见任何组织或脏器异常。

2)蓄积毒性试验：试验连续进行28 d，小鼠均无死亡，蓄积系数K>5，参照《消毒技术规范》[13]中的蓄积毒性分级可知，该消毒剂为轻度蓄积毒性。

3)皮肤刺激试验：观察1、24、48 h后，结果显示实验动物皮肤刺激反应无红斑和水肿形成，皮肤刺激积分均为0，皮肤刺激指数<0.5，参照《消毒技术规范》[13]中的皮肤刺激评价标准可知，对小鼠皮肤无刺激性。

3 讨论

结核病是目前由单一致病菌导致死亡最多的疾病，是全球关注的重大公共卫生问题之一。我国是全球27个耐多药肺结核高负担国家之一，2007-2008年全国结核病耐药性基线调查结果显示，肺结核患者中耐多药率为8.32%。据此估算，我国每年新发耐多药结核患者12万例，耐多药结核病患者数位居全球第2位。耐多药肺结核患者与普通肺结核患者相比，传染期更长，传染危害更大[14]。消毒剂是切断结核分枝杆菌传播途径的有效手段之一，对消毒剂的研究应引起研究者的重视。

本研究结果表明，LVA-SDS消毒剂对结核分枝杆菌标准株H37Rv、耐多药结核分枝杆菌临床分离株均存在较好的杀灭作用。本实验所设定的一系列梯度浓度的消毒剂得到的杀灭试验结果显示，LVA-SDS消毒剂的杀灭作用随着作用时间和作用浓度的增加不断增强；20%LVA、20%LVA+2%SDS对结核分枝杆菌标准株H37Rv、耐多药结核分枝杆菌临床分离株作用30 min后的平均杀灭对数值均>5.00，且连续培养观察2～3个月后未见新鲜菌落生长。20%(体积分数)LVA、20%(体积分数)LVA+2%(质量分数)SDS、1 000 mg/L次氯酸钠和阳性对照组对结核分枝杆菌及耐多药结核分枝杆菌临床分离株作用30 min的杀灭作用差异均有统计学意义；相比同浓度的LVA， LVA-SDS联合作用的杀灭作用会更趋于稳定，效果会更好，此结果与文献报道[9,15]一致，即两者具有协同杀灭作用。LVA-SDS对结核分枝杆菌标准株H37Rv、耐多药结核分枝杆菌临床分离株杀灭作用与消毒剂的浓度和作用时间成正相关。根据本研究结果LVA-SDS有可能用于临床结核分枝杆菌的灭菌消毒，如器械消毒、空气消毒等。结合本研究获得的毒理学结果，LVA-SDS在未来杀灭结核分枝杆菌的过程中具有对皮肤无刺激性、对人体无急性和慢性毒性等优势。可见，LVA-SDS对结核分枝杆菌除了有很好的杀灭作用，还具有很好的安全性、无腐蚀性、无害无污染、无刺激性、无不良作用等优点[9,15-16]。LVA-SDS混合液在常温下保存60 d性质稳定且杀灭活性不变[17]。

1 000 mg/L含氯消毒剂的对照组对结核分枝杆菌标准株H37Rv、耐多药结核分枝杆菌临床分离株作用30 min后的平均杀灭对数值均>5.00，可达到完全杀灭作用。可见，含氯消毒剂确实存在较强的杀灭作用。与含氯消毒剂相比较，LVA-SDS消毒剂虽然在短时间和低浓度时的杀灭作用稍差，但是高浓度和长时间作用后却有着不错的杀灭效果。另外LVA-SDS具有无害无污染、安全性好等优点，而含氯消毒剂具有刺激性强和腐蚀性等缺点。因此，LVA-SDS用于结核分枝杆菌的消毒工作具有不错的应用前景。

本研究显示，LVA-SDS对结核分枝杆菌标准株H37Rv、耐多药结核分枝杆菌临床分离株具有较好的杀灭作用，且毒理学实验结果显示LVA-SDS消毒剂属实际无毒级，轻度蓄积毒性作用且对皮肤无刺激性，具有较强的实际应用价值。笔者在后续研究中会结合医院感染控制的实际需要，不断改变LVA-SDS对结核分枝杆菌杀灭作用的实验条件和影响因素，进一步提高LVA-SDS消毒剂的应用价值。