溴化N-丁基-甲基苯并咪唑离子液体对大肠杆菌的抑制作用

朱伟豪，张维海，海 雯，张凯华，李泽浩，徐兴敏，3，4

离子液体(ionic liquid, ILs)是完全由离子组成的在室温或较低使用温度(<150 ℃)下呈液态的盐，一般由较大的有机阳离子和较小的无机阴离子组成[1-2]。由于离子液体具有低挥发性、高溶解性和强稳定性等优点，被称为“绿色溶剂”，广泛应用于化学、化工、环境和生物等领域[3]。近年来，随着清洁生产和环境保护的要求，有关离子液体毒性的研究逐渐受到人们广泛重视[4-6]，离子液体的毒性预测方法得到初步建立[7-8]。在离子液体规模应用之前，前瞻性地研究其毒性，具有重要的意义。

有关咪唑类离子液体的毒性研究已广见文献报道[9-12]，而苯并咪唑类离子液体的毒性研究还少见文献报道。苯并咪唑是一种含有两个氮原子的苯并杂环化合物，比咪唑更稳定，更易于进行结构修饰[13-14]。其衍生物及金属配合物具有良好的生物活性，有一定抗癌、抗真菌、镇痛消炎等药用价值[15]。本文选择大肠杆菌作为受试微生物，考察溴化N-丁基-甲基苯并咪唑离子液体对微生物的毒性作用，为苯并咪唑类离子液体的环境效应评价提供参考，现报道如下。

1 材料与方法

1.1试剂与仪器溴化N-丁基-甲基苯并咪唑离子液体(99%，上海成捷化学有限公司)；大肠杆菌感受态(DH5α，北京康为世纪生物科技有限公司)；琼脂粉、胰蛋白胨、氯化钠、 酵母膏(河南信思分析科技有限公司)。隔水式电热恒温培养箱(GNP-9080型，上海贺德实验设备有限公司)；恒温培养摇床(HY-45型，武汉汇城生物科技有限公司)；高压灭菌锅(XT-S-280A型，浙江新丰医疗器械有限公司)；生物光学显微镜(XSP-2CA型，上海光学仪器五厂有限公司)；高精度分析天平(ME104，梅特勒电子天平，上海天平仪器技术有限公司)；超净工作台(SW-CJ-1F型，苏州合飞净化设备有限公司)。

1.2实验方法

1.2.1不同浓度离子液体的配制配制浓度为5.0 mg·mL-1的离子液体母液，依次稀释为：0.25～5 mg·mL-1(每0.25 mg·mL-1为一浓度梯度)；另取蒸馏水，作为离子液体空白对照。

1.2.2大肠杆菌菌液配制在无菌操作台上将大肠杆菌感受态接种在固体培养基上，37 ℃培养16 h。取单个菌落接种到50 mL液体培养基内，放置37 ℃，震荡200 r·min-1的摇床培养箱培养18 h，制得菌液备用。

1.2.3离子液体抑制作用预实验取不同浓度离子液体(0～5 mg·mL-1)加入培养基中，进行大肠杆菌培养，发现离子液体浓度在0.5～2.5 mg·mL-1对大肠杆菌生长影响明显(即低于0.5 mg·mL-1与空白对照没有明显区别，高于2.5 mg·mL-148 h均无肉眼可见菌群生成)。

1.2.4离子液体抑制作用操作过程①培养基制备：取6个锥形瓶，均加入琼脂粉0.5 g、胰蛋白胨0.5 g、氯化钠 0.5 g、酵母膏0.2 g，分别加入50 mL配好的浓度为0、0.5、0.75、1.0、1.5、2.5 mg·mL-1的溴化N-丁基-甲基苯并咪唑离子液，标记后震荡摇匀，调pH为7.4。②高压蒸汽灭菌：121 ℃灭菌15 min。③铺板： 15 mL固体培养基在每个培养皿中进行铺板冷却，每个离子液体浓度设置3次平行实验。④接种：每个培养皿用接种环(环大小直径一致)以“己”字形顺序接种9个点，3组培养基分别接种。接种后放入37 ℃恒温箱恒温倒置培养。⑤每8 h观察大肠杆菌的生长情况并记录、拍照。

1.2.5高倍显微镜观察大肠杆菌形态①涂片；②染色；③镜检。

2 结果

2.1离子液体浓度对大肠杆菌生长的影响随着溴化N-丁基-甲基苯并咪唑离子液体浓度的增加，大肠杆菌菌群生长受到抑制，当离子液体浓度小于0.5 mg·mL-1时对菌群生长影响并不明显；当离子液体浓度达到0.75 mg·mL-1以上时，随着浓度的逐渐增大，离子液体会逐渐抑制菌群的生长速度，培养48 h生成的菌群斑点明显减小；当离子液体浓度达到2.5 mg·mL-1时，培养48 h无肉眼可见菌群斑点形成，见图1。

A:对照；B:0.5 mg·mL-1；C:0.75 mg·mL-1；D:1 mg·mL-1;E:1.5 mg·mL-1;F:2.5 mg·mL-1。图1 不同离子液体浓度对大肠杆菌生长的影响(培养48 h)

2.2培养时间对大肠杆菌生长的影响对照组培养8 h即可明显观察到大肠杆菌生长形成的斑点，培养24 h后形成厚实的菌群斑点；而离子液体浓度为0.5 mg·mL-1时8～16 h仅形成浅淡的菌落斑点，培养24 h以后才形成明显菌落斑点；离子液体浓度为0.75 mg·mL-1时，培养8 h只有前6个点长出，其余3个点不明显，16～32 h才形成浅淡斑点，40 h后形成明显斑点；当离子液体浓度为1～1.5 mg·mL-1时，培养8 h只有前2～4点长出，其余斑点不明显，8 h后均为浅淡斑点；当离子液体浓度达到2.5 mg·mL-1时48 h内均未形成肉眼可见菌落斑点，见表1。

表1 培养时间对大肠杆菌生长情况的影响

注：每个培养皿上接种9个点，以眼睛观察辨别生长情况，实验结果为3次平行结果。

2.3离子液体对大肠杆菌形态的影响高倍显微镜下观察，随着溴化N-丁基-甲基苯并咪唑离子液体浓度的增加，大肠杆菌的菌群密度越来越低，但是大肠杆菌的个体形态越来越长，比正常大肠杆菌的个体形态发生明显的变化，见图2。

A：0 mg·mL-1；B：0.75 mg·mL-1；C：1.5 mg·mL-1；D：2.5 mg·mL-1。A、B、C均培养48 h，D培养96 h；像素：800×600；放大倍数：1 000。图2 不同离子液体对大肠杆菌毒化抑制作用(HE,×1 000)

3 讨论

可见溴化N-丁基-甲基苯并咪唑离子液体的毒性与其浓度关系密切，在一定的浓度范围内，离子液体的毒性随其浓度的增大而增大。离子液体的浓度对其毒性的影响规律为：低浓度时，其毒性效应增加较为缓慢(0.5 mg·mL-1以下)；高浓度时，离子液体的毒性急速增加(0.75～2.5 mg·mL-1)；但是，当浓度继续增大时，其毒性效应又趋于平缓(2.5 mg·mL-1以上)。其毒性与浓度之间的关系表现为“S”型浓度-效应曲线，与相关文献报道一致[16]。

时间对大肠杆菌生长的影响规律表现为：低浓度时，时间对大肠杆菌生长影响显著，随着时间的延长，大肠杆菌菌群成活密度越来越高；高浓度时(1.0 mg·mL-1以上)，由于受到毒化抑制作用，时间对大肠杆菌生长影响逐渐下降，直至无影响。其毒化抑制机制可能是在高浓度下，由于离子液体的毒化作用，影响了大肠杆菌二分裂，使其在繁殖期菌体内物质正常复制，但无法正常分裂成两个，只能在两个菌体之间形成凹型链接(电镜下可见)。因此随着繁殖次数的增加，大肠杆菌不断地从两端延长，形成了比正常大肠杆菌形态明显改变的菌体。

根据有关文献报道[17-18]，苯并咪唑类化合物是一种活性较强的内吸型杀菌剂，其作用机理是与植物病原的β-微管蛋白结合，破坏β-微管蛋白的功能，抑制病原菌的有丝分裂和形态建构，而达到杀菌的目的。此结论有力地证明了对其毒性抑制作用机制的推测，但有待进一步实验验证。

总之，通过讨论可得到结论如下：①溴化N-丁基-甲基苯并咪唑离子液体对大肠杆菌生长有一定的抑制和毒化作用；②随着溴化N-丁基-甲基苯并咪唑离子液体浓度的增加，其毒化抑制作用增强，但不能完全灭活大肠杆菌；③高浓度下(2.5 mg·mL-1)，由于毒化作用，导致菌体形态发生明显改变。