响应面法优化鸡胸肉蛋白酶解工艺

安攀宇，赵 珊，张 淼，李燮昕，李 维，王 鑫

（四川旅游学院食品学院，四川 成都 610100）

鸡肉作为人类的日常食物，具有较高的蛋白质含量，同时由于其低脂肪和低胆固醇含量受到人们的普遍青睐，也被称为营养之源。在居民的食谱中，鸡肉仅次于猪肉，成为人类消费的第二大肉类产品，鸡肉滋味鲜美，适合多种烹调方法[1]。近年来，随着经济的发展，居民消费水平不断提升，肉类食品消费量逐渐递增，仅2000—2016年，世界范围内人类整体的鸡肉产量增长4.07%，消费量平均增长4.27%。其中，在全球不同地区和国家的分布上，主要集中在美国、巴西和中国，这几个国家的鸡肉消费量占全球的比例分别为20.60%、14.60%和13.90%，中国每年人均消费量为10 kg，美国42 kg，巴西48 kg[2]。与美国和巴西相比，我国人均鸡肉消费水平较低，未来增长空间较大。利用现代食品加工技术对鸡胴体中最大的分割产品鸡胸肉进行深加工既是提高其资源利用率和附加值的有效途径，也能丰富鸡肉终端产品种类，利用科技手段增强食品行业的科技含量，有利于我国食品企业增强自身的竞争水平和行业抗风险能力[3-4]。

水解动物蛋白富含氨基酸，营养成分相对较高，具有水溶性好的特点，可以改善食物的风味，使其更好地融入动物的自然味道。水解动物蛋白作为新型的食品添加剂，可广泛应用于复合调味品和营养强化食品加工中[5]。因此，大量的水解动物蛋白成分被广泛应用到食品加工生产领域，尤其是保健食品和复合调味品领域。目前，动物水解蛋白主要基于酶法水解获取，在水解过程中可以保留原有的鲜味，富含活性肽。Shahidi[6]的研究也显示，在动物的水解蛋白中含有大量的游离氨基酸。动物水解蛋白中，氯丙醇等对人体有害的成分几乎不存在，因此具有很好的市场前景。前人研究多集中在使用正交试验对蛋白酶进行分步水解[7]，或将蛋白酶进行简单复配来对鸡肉进行酶解[8]。对于如何从众多蛋白酶中选择合适的酶来水解鸡胸肉，且如何将多酶进行复配，均未进行深入探讨。另外，多数研究对于水解液的感官指标并未进行分析或将各项感官得分汇总分析，并未集中研究作为热反应前体物质的水解液在感官指标上应具备哪些突出特点[9]。本研究通过采集家养鸡鸡胸肉作为研究标本，在实验设计上采用单因素试验和响应面试验方法，通过对感官指标和水解度的分析，对蛋白水解酶种类和复配蛋白酶酶解条件的选择进行研究，通过改进试验方法获取更为优质的酶解液，并将其作为热反应的前体物质，从而为鸡肉蛋白水解物的推广使用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

冻鸡胸肉，市售，购自永辉超市。

复合蛋白酶（70 000 U/g）、风味蛋白酶（500 LAPU/g）、肉类水解专用酶（3 5 0 0 0 U/g）、中性蛋白酶（1 600 AU/g）、木瓜蛋白酶（90 000 U/g）、胰蛋白酶（40 000 U/g） 河南圣斯德实业有限公司；甲醛（含量37%～40%） 成都金山化学试剂有限公司；氢氧化钠（含量≥96%） 天津鼎盛鑫化工有限公司；pH缓冲剂 上海雷磁-创益仪器仪表有限公司。

1.2 仪器与设备

H2050R台式高速冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；DZKW-S-8电热恒温水浴锅 北京市永光明医疗仪器有限公司；ST2100 pH计 奥豪斯仪器（常州）有限公司；85-1磁力搅拌器 江苏省金坛市医疗仪器厂；DS-1高速组织粉碎机 上海标本模型厂；YP-N电子天平 上海精密仪器仪表有限公司；835-50氨基酸分析仪 日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 鸡胸肉酶解液的制备

鸡胸肉去除结缔组织和脂肪→洗净→切成颗粒状→匀浆→按比例加入蒸馏水→加酶恒温酶解（水浴）→灭酶（100 ℃，10 min）→离心（7 000 r/min，4 ℃，15 min）→取上清液[10]

1.3.2 水解度测定

采用固定的方法，通过外部条件的控制，可以使蛋白质肽键水解断裂，水解后断裂的肽键数与总数的比为水解度。通常根据行业相关的测定方法采用水解后释放的氨基酸数进行测定[11-12]。水解度按照下式计算。

其中，通过凯氏定氮法对总蛋白氮含量进行测定[13]；采用甲醛滴定法对游离氨基酸含量进行测定[14]。

1.3.3 氨基酸组成分析

采用Hitachi 835-50型氨基酸分析仪进行氨基酸成分测定。

1.3.4 感官评定

经过专门培训的人员组成感官评定小组，共计8 名成员，年龄20～30 岁。样品的盐含量为0.50%，待测时的温度为（25±1） ℃。在筛选过程中，对6 种酶解液进行评价，对不同的味道指标，如甜味、酸味等，基于感官评分法[15]进行评价。

在感官评定中设置对照组[16]，对照组为2 g/100 mL麦芽糊精溶液。

在评定标准的选取上，采取1～7 分的不同档次，其中1 分为非常弱，7 分为很强，中间依次为很弱、对照组、一般、稍强、比较强。感官评定结果取8 人评定结果的平均值。

1.3.5 单因素试验设计

1.3.5.1 蛋白酶种类的筛选

在选定鸡胸肉标本后，采用6 种不同蛋白酶对其进行水解，分别为复合蛋白酶、风味蛋白酶、肉类水解专用酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶。不同的酶在酶解过程中具有不同的特点，而与不同底物进行反应也会产生不同的特征[17-19]。基于预实验获取的实验数据和参数，综合考虑相关的因素，选取统一的酶解基础工艺[20-22]，如表1所示。通过对水解度和感官评分的分析，筛选出2 种水解效果较好的单酶进行下一步的复配。

表1 鸡胸肉酶解基础工艺Table 1 Initial enzymatic hydrolysis conditions of chicken breast proteins

1.3.5.2 木瓜蛋白酶、复合蛋白酶复配比例的选择

在单因素试验基础上，选取水解度作为评价指标，研究木瓜蛋白酶和复合蛋白酶2 种单酶的水解效果以及二者复配后的水解效果，每组实验重复3 次。

1.3.5.3 复配蛋白酶酶解条件的选择

将复合蛋白酶与木瓜蛋白酶进行复配（复配比例2∶1），选取水解度作为评价指标，分别研究不同的复配比例、复配蛋白酶添加量、酶解时间、反应温度以及固液比对鸡胸肉水解效果的影响，每组实验重复3 次。

1.3.6 复配蛋白酶酶解条件优化的响应面试验设计

选择复配蛋白酶复配比例（复合蛋白酶∶木瓜蛋白酶）、复配蛋白酶添加量、酶解温度以及固液比（鸡胸肉泥∶蒸馏水）4 个因素，在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken法进行4因素3水平的响应面试验，以水解度为响应值。相应的因素水平如表2所示，进行3 次重复试验。

表2 响应面试验设计因素与水平Table 2 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used for Box-Behnken design

1.4 数据处理

整理后的数据采用SPSS 22.0分析软件进行统计学检验及方差分析。

2 结果与分析

2.1 蛋白水解酶种类筛选结果

由预实验测得本研究所用鸡胸肉的蛋白质含量为23.30%，不同酶类的靶点存在很大的差异性，因此其水解产物也有很大不同，会呈现多种风味和水解效果。

图1 不同蛋白酶对鸡胸肉水解度的影响Fig. 1 Effect of different proteases on hydrolysis degree of chicken breast proteins

6 种蛋白酶的酶解液均呈淡黄色、澄清状，并无感官上的差异。由图1可知，在相同的水解工艺条件下，6 种蛋白酶均对鸡胸肉蛋白质有水解作用，水解效果较好的是复合蛋白酶和木瓜蛋白酶，二者水解鸡胸肉时的水解度分别为24.68%和23.55%，显著高于其他蛋白酶（P＜0.05）。

图2 鸡胸肉酶解液的感官评分Fig. 2 Sensory scores of chicken enzymatic hydrolysates

由图2可知，使用肉类水解专用酶得到的酶解液略苦且味道寡淡，而风味蛋白酶和中性蛋白酶的酶解液鲜味浓郁，醇厚丰满。总体来说，6 种蛋白酶制得的鸡胸肉蛋白酶解液均呈现出鲜味突出、醇厚感、持续感较强、甜味平淡、苦味和酸味不明显的感官特点，各试验组均有较佳风味。陈怡颖等[23]的研究中曾经提到，在动植物蛋白酶酶解过程中，会出现苦味、腥味，但在本研究中未发现，这可能与鸡肉特有的氨基酸模式相关，其内部含有大量的鲜味氨基酸，而苦味氨基酸相对较少。Ner[24]的研究表明，一般苦味较重主要是肽链末端存在大量的疏水性氨基酸所致。在本研究中，鸡胸肉水解时，其内部的疏水性氨基酸被包裹在肽链内，并没有游离出来，与味蕾接触，因而风味相对比较甘甜。

在本研究中的同一水解工艺下，使用6 种蛋白酶对鸡胸肉进行酶解制得产品的感官接受程度无太大差异。因此，最终选择对鸡胸肉水解度较高的复合蛋白酶和木瓜蛋白酶进行复配。

2.2 木瓜蛋白酶与复合蛋白酶复配的选择

由图3可知，对于鸡胸肉，复配蛋白酶的水解效果均远优于单酶（P＜0.05），这是由于每种酶对肽键的水解具有专一性[25]，复配蛋白酶可以多位点水解蛋白质。当木瓜蛋白酶与复合蛋白酶复配比例为1∶2时，得到的酶解液的水解度在各试验组中最高，达31.20%。对于鸡胸肉，复合蛋白酶的单酶水解效果强于木瓜蛋白酶（P＜0.05），因此，后期将2 种单酶进行复配时，应考虑增大复合蛋白酶用量，以得到更好的水解效果。

图3 木瓜蛋白酶与复合蛋白酶复配对鸡胸肉水解度的影响Fig. 3 Effect of papain and protamex formulation on hydrolysis degree of chicken breast proteins

2.3 复配蛋白酶水解条件的单因素试验结果

图4 酶解时间对鸡胸肉水解度的影响Fig. 4 Effect of hydrolysis time on hydrolysis degree of chicken breast proteins

由图4可知，随着酶解时间的延长，经复配蛋白酶处理的鸡胸肉水解度持续增加，当酶解时间为4.0 h时，水解度增加速率开始变慢。根据姚宏亮等[26]的报道，采用水解法对禽肉进行水解，其水解度为30%时，出现最佳风味，当水解度不断增加，超过30%时，禽肉酶解液反而会出现苦味。本研究中，当酶解时间大于4.0 h时，鸡肉蛋白酶解液的水解度超过30%，因此，综合考虑效率及成本问题，复配蛋白酶水解时间选4.0 h为宜。

图5 酶解温度对鸡胸肉水解度的影响Fig. 5 Effect of hydrolysis temperature on hydrolysis degree of chicken breast proteins

由图5可知，当复配蛋白酶的酶解温度为55 ℃时，鸡胸肉酶解液的水解度远高于其他温度条件，且差异显著（P＜0.05）。在复配蛋白酶对鸡胸肉蛋白质的作用过程中，其水解度会随着温度的升高先升高后降低。这种变化趋势主要是由于低温时水解反应占据主导地位，酶的活性不断增强，并且相对稳定，水解效率相对较高；后期随着温度升高到一定的程度和限度，其内部的水解反应速率增加，但酶失去自身活性的速率也在加快，底物生成产物的速率也在不断降低，酶解效率降低[27]，稳定性较差，因而，复配蛋白酶的最佳酶解温度为55 ℃。

图6 复配蛋白酶总酶量对鸡胸肉水解度的影响Fig. 6 Effect of enzyme dosage on hydrolysis degree of chicken breast proteins

由图6可知：复配蛋白酶的总酶量在1.0%～1.5%的范围内不断增加时，鸡胸肉酶解液的水解度增长较快（P＜0.05）；当总酶量从1.5%增加到3.0%时，鸡胸肉酶解液的水解度基本无变化（P＞0.05）。这主要是由于底物量有限，在底物反应速率不断提升的过程中，底物容量有限，会被消耗殆尽；在没有底物继续参加反应时，无法提高其水解度。为了节约酶用量、降低成本，确定水解鸡胸肉蛋白质时的复配蛋白酶最适总酶量为1.5%。

图7 固液比对鸡胸肉水解度的影响Fig. 7 Effect of solid-solvent ratio on hydrolysis degree of chicken breast proteins

由图7可知，在固液比不断减小的过程中，鸡胸肉酶解液的水解度先增加后变小，水解度最高峰值为30.90%，此时的固液比为1∶4。固液比的变化影响底物浓度，底物浓度高即溶质多，由于缺乏流动性，不能与酶进行充分的接触，从而不能充分进行反应；在底物浓度相对较小时，其内部的流动性比较好，有利于酶解反应的进行[28]。当底物浓度减小到一定程度时，二者接触的几率较小，反应有限，此时水解度较低[29]。在底物浓度较低时，水的用量会增大，不利于后续干燥浓缩等操作。因此，复配蛋白酶水解鸡胸肉的最适固液比为1∶4。

图8 复合蛋白酶与木瓜蛋白酶复配比例对鸡胸肉水解度的影响Fig. 8 Effect of protamex/papain ratio on hydrolysis degree of chicken breast proteins

由图8可知，随着复合蛋白酶与木瓜蛋白酶复配比例的增大，鸡胸肉蛋白的水解度总体呈现先升高后降低的趋势。当复合蛋白酶与木瓜蛋白酶复配比例为3∶1时，鸡胸肉酶解液的水解度达32.62%，显著高于其他试验组（P＜0.05）。造成水解度先升高后降低的原因可能是在水解能力上，复合蛋白酶比木瓜蛋白酶效果好（图3），在复合蛋白酶的量不断增加的同时，其水解度也趋于增加；但当二者的量超过一定限度时，会产生互为底物的反应，相互进行水解，通常由具有较强活力的酶水解活力较弱的酶，导致部分酶的活性大大降低，从而在水解鸡胸肉方面的效率明显降低，最终导致水解度下降。因此，可以确定复合蛋白酶与木瓜蛋白酶的最适复配比例为3∶1。

2.4 复配蛋白酶水解条件的响应面试验结果

表3 Box-Behnken试验设计及结果Table 3 Box-Behnken experimental design with experimental results

根据单因素试验结果，综合考虑效率及成本问题，复配蛋白酶水解时间不宜过长，且通过单因素试验已经确定复配蛋白酶的水解时间为4 h为宜。采用响应面Box-Behnken设计29 组试验（其中5 组为中心点重复试验）[30]，以鸡胸肉蛋白质水解度为响应值，考察酶解反应体系中固液比（A）、复配蛋白酶添加量（B）、复合蛋白酶与木瓜蛋白酶复配比例（C）及酶解温度（D）对鸡胸肉蛋白质水解度的影响。响应面试验结果及分析如表3～4所示。

表4 响应曲面二次回归模型的方差分析结果Table 4 Analysis of variance of quadratic regression model

由表4可知，该试验模型P值＜0.01，说明不同试验组别间差异极显著，4 个自变量，即固液比（A）、复配蛋白酶添加量（B）、复合蛋白酶与木瓜蛋白酶复配比例（C）及酶解温度（D）之间存在显著的线性关系，方法具有较高的可靠性。失拟项Prob＞F为0.546 1＞0.05，差异不显著，表明实验误差小。模型拟合系数R2=0.978 5，校正拟合系数为R2Adj=0.957 0，表示该模型能够解释水解度有95.70%的变化来自所选变量，不能解释的部分仅为4.30%。提示该模型适合用于研究所选4 个因素的变化对鸡胸肉蛋白质水解度的影响和预测分析。信噪比为19.976，信噪比在4以上，提示模型拟合度和可信度较高。采用Desgin-Expert 8.06程序进行二次多项式回归，得到的方程为水解度＝-188.285 75＋11.226 24A＋21.091 11B-0.938 80C＋6.875 26D＋1.141 00AB＋0.493 83AC-0.085 65AD＋3.181 50BC-0.220 81BD-0.013 40CD-1.298 33A2-5.754 64B2-1.129 43C2-0.058 45D2。

对上述方程的回归系数进行显著性检验表明，因素A、C、AC、AD对鸡胸肉蛋白质水解度的影响显著（P＜0.05），因素D以及AB、BC、BD的两两因素交互作用对鸡胸肉蛋白质水解度的影响极显著（P＜0.01）。

图9 固液比和复配蛋白酶添加量交互影响鸡胸肉蛋白质水解度的响应曲面图及等高线图Fig. 9 Response surface plot and contour plot showing the interactive effect of solid/solvent ratio and enzyme dosage on hydrolysis degree of chicken breast proteins

图10 固液比和复合蛋白酶与木瓜蛋白酶复配比例交互影响鸡胸肉蛋白质水解度的响应曲面图及等高线图Fig. 10 Response surface plot and contour plot showing the interactive effect of solid/solvent ratio and protamex/papain ratio on hydrolysis degree of chicken breast proteins

图11 固液比和酶解温度交互影响鸡胸肉蛋白质水解度的响应曲面图及等高线图Fig. 11 Response surface plot and contour plot showing the interactive effect of solid/solvent ratio and hydrolysis temperature on hydrolysis degree of chicken breast proteins

图12 复配蛋白酶添加量和复合蛋白酶与木瓜蛋白酶复配比例交互影响鸡胸肉蛋白质水解度的响应曲面图及等高线图Fig. 12 Response surface plot and contour plot showing the interactive effect of enzyme dosage and protamex/papain ratio on hydrolysis degree of chicken breast proteins

图13 复配蛋白酶添加量和酶解温度交互影响鸡胸肉蛋白质水解度的响应曲面图及等高线图Fig. 13 Response surface plot and contour plot showing the interactive effect of enzyme dosage and hydrolysis temperature on hydrolysis degree of chicken breast proteins

图14 复合蛋白酶与木瓜蛋白酶复配比例和酶解温度交互影响鸡胸肉蛋白质水解度的响应曲面图及等高线图Fig. 14 Response surface plot and contour plot showing the interactive effect of protamex/papain ratio and hydrolysis temperature on hydrolysis degree of chicken breast proteins

由图9～14可知，AB、AC、AD、BC、BD、CD的两因素交互作用响应曲面图呈抛物线状，存在峰值。随着固液比、复配蛋白酶添加量、复合蛋白酶与木瓜蛋白酶复配比例或酶解温度的不断增加，鸡胸肉蛋白质水解度呈现先升后降的趋势。其中，固液比、复合蛋白酶与木瓜蛋白酶复配比例、酶解温度对水解度影响较大。圆形等高线提示两因素交互作用不强，椭圆形、马鞍形等高线提示两因素具有明显的交互作用。除CD两因素交互作用的等高线图为圆形外，其余两因素的等高线图均为椭圆形，说明CD两因素的交互作用不显著，其余两两因素之间交互作用显著（或极显著）。响应曲面图及等高线图结果与回归模型方差分析的结果一致。

2.5 验证实验结果

根据Box-Behnken试验设计所得的结果和二次多项回归方程，通过Design Expert V8.0.6软件预测出鸡胸肉蛋白的最佳酶解条件为固液比1∶4.20、复配蛋白酶添加量2.16%、复合蛋白酶与木瓜蛋白酶复配比例3.24∶1、酶解温度51.29 ℃（实际实验过程取51.30 ℃）。在上述条件下，鸡胸肉的蛋白水解度达32%以上，可以通过在最佳水解条件下进行水解来监测模型精确度，进行3 组平行实验，鸡胸肉的蛋白水解度为（32.71±0.51）%，从而可以得到通过响应面分析法对其最佳酶解条件进行优化是可行的。

2.6 鸡胸肉蛋白酶解液的氨基酸成分分析

根据优化得到的最佳工艺条件制备鸡胸肉蛋白酶解液，并对其进行游离氨基酸含量测定。17 种游离氨基酸在肉类风味中发挥着重要的作用[31]，在制备肉味香精的过程中，更容易发生反应[32-34]。

表5 鸡胸肉蛋白酶解液的氨基酸成分分析Table 5 Analysis of amino acid composition of chicken breast enzymatic hydrolysate

由表6可知，17 种游离氨基酸在鸡胸肉蛋白酶解液中的含量相对丰富，高达9.23%。鸡胸肉蛋白酶解液含有人体所需的8 种氨基酸，且含量较高，占酶解液游离氨基酸总量的50.16%，6 种鲜味氨基酸占总量的38.24%。此外，蛋氨酸、半胱氨酸等含硫氨基酸也在酶解液中有所体现。由此可见，利用木瓜蛋白酶和复合蛋白酶复配，酶解鸡胸肉蛋白得到的酶解液是一种氨基酸效价高且全的动物蛋白水解液，且由于含有大量呈味氨基酸和含硫氨基酸，该酶解液亦能作为肉味香精前体物。

3 结 论

基于单因素试验设计，以鸡胸肉蛋白水解度为响应值，通过4因素3水平的Box-Behnken响应面试验设计，优化得到在pH值7.00、酶解时间4 h时，鸡胸肉蛋白酶解的最佳工艺条件为：选择复合蛋白酶和木瓜蛋白酶进行复配，复合蛋白酶与木瓜蛋白酶复配比例3.24∶1、复配蛋白酶添加量2.16%、酶解温度51.29 ℃、固液比1∶4.20。通过此工艺条件制得的鸡胸肉蛋白酶解液的水解度达到32%左右，与软件预测结果一致。

使用雷达图进行感官分析可以直观地看出，鸡胸肉蛋白酶解液的风味主要体现在鲜味、持续感和醇厚感上，这些风味特色是作为热反应前体物质的重要条件，因此，使用这些指标来筛选复配蛋白酶的种类较为合适。在复配2 种蛋白酶时，本研究不仅将复配蛋白酶和单酶的水解能力进行比较，还将2 种单酶的复配比例进行正负向比较，进而确定出2 种单酶复配的比例方向。本研究得到的鸡胸肉蛋白酶解液外观呈淡黄色、澄清状，肉香浓郁，鲜味明显，无苦味、腥味；其中人体必需氨基酸和呈味氨基酸含量均较高，在营养和食品方面具有较高的使用价值。