一个中国北方汉族不宁腿综合征家系的基因学筛查研究

薛云 申珅 刘雅萍 崔艺浓 杜艺彤 肖玉莲 脱厚珍

不宁腿综合征(restless legs syndrome，RLS)是常见的神经系统感觉运动障碍性疾病，其主要表现为难以名状的腿部不适感，如酸胀、针刺等，并迫使患者产生活动下肢的冲动，症状在休息或夜间时发生或加重，活动后上述症状可减轻。既往对RLS的遗传学研究发现了多个与不安腿相关的遗传位点。全基因组关联分析发现MAOA、MEIS1、BTBD9、MAP2K5/LBXCOR1、PTPRD、NOS1基因可能增加RLS患病风险[1]。国内相关研究较少，可能与家系人员分散，样本获取困难等有关。本研究通过对一个患病人数多，患病程度重的RLS家系进行MassARRAY质谱法检测单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)位点，从而推测与该家系发病可能有关的基因及SNPs，进一步探究国内RLS家系遗传特点。

1 材料和方法

1.1观察对象选取首都医科大学附属北京友谊医院神经内科门诊就诊的RLS患者，从中筛选出家族人数较多、遗传方式明确的家系。获得知情同意后，由2位神经科医师收集该家系先证者及患病成员的临床资料，包括病史、体格检查等。RLS诊断标准依据2014年国际不安腿综合征协作组颁布的诊断指南[2]。并以IRLS-RS量表(International RLS Rating Scale，IRLS-RS)对RLS症状的严重程度评分，从而进行严重程度分级。

1.2采集血样对家系中患者及其亲属成员每人抽取外周静脉血4 mL，EDTA抗凝管保存，共收集有效血样12份提取DNA，均DNA浓度≥5 ng/μL，-20°C保存备后续实验，其中Ⅱ1、Ⅱ5、Ⅱ7、Ⅲ3、Ⅲ6、Ⅲ7、Ⅲ9、Ⅲ10均未提供血样。

1.3MassARRAYSNP检测

1.3.1SNP选择及引物设计：通过总结文献，选择了国内外已报道与RLS发病相关的SNP位点，共涉及8个基因20个SNP位点[3]。采用 Agena 公司在线引物设计软件 Assay Design Suite v2(https：//seqpws1.agenacx.com/AssayDesignerSuite.html)在线设计引物，基因及SNP位置及引物序列见表1。

1.3.2多重PCR扩增反应：在同一PCR反应体系里加上2对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。反应池包含多个SNP位点的正向和反向PCR扩增引物mix、PCR缓冲液、DNA模板、Taq DNA聚合酶、dNTP Mix、MgCl2等。反应条件：95℃ 120 s；95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 60 s，循环45次；72℃ 5 min，4℃保存。

1.3.3碱性磷酸酶化处理：用碱性磷酸酶降解PCR反应未消耗完的三磷酸碱基脱氧核苷酸(dNTPs)。1个反应体系池中包括碱性磷酸酶、碱性磷酸酶缓冲液等。反应条件：37℃ 40 min；85℃ 5 min，4℃保存。

1.3.4SNP位点特异性单碱基延伸反应：多重SNP位点特异性引物延伸反应，即在PCR扩增后的产物中，加入SNP序列特异延伸引物，在SNP 位点上，延伸1个碱基，并进行脱盐处理。

1.3.5点样及分析数据：扩增产物经树脂除盐纯化后，点样到覆盖有基质的SpectroCHIP芯片阵列中进行质谱检测。采用MassARRAYTyper软件解读质谱检测的分子量峰，转化显示为SNP 位点所对应的分子量质谱峰图，从而明确位点单核苷酸基因分型结果。

1.4单体型分析单体型是指位于一条染色体特定区域的一组相互关联，并倾向于以整体遗传给后代的单核苷酸多态的组合，又称单倍体型或单元型。基于SNPs基因分型结果及家系图，选择直系家系成员基因分型完整的家庭成员进行分析，完善家系图并分析可能存在的相关致病基因。

2 结果

2.1家系情况入组家系现存3代，根据不宁腿综合征诊断标准(2014)，明确的RLS患病者9人，其中男性患者3人，女性患者6人；严重程度为重度患者2人(29分)，严重程度为中度患者2人(18分及19分)，严重程度为轻度5人。先证者(Ⅱ3，图1)女性，75岁，汉族，约60年前开始出现双下肢难以名状的不适感，安静状态下出现，不能静坐学习，按摩或走动后不适感减轻，平卧时症状加重，予其左旋多巴胺制剂及多巴胺受体激动剂治疗后，症状好转；无贫血、慢性肾病或多发性硬化等病史。神经系统检查未见明显异常。

表1 已知基因SNP位点及引物序列

2.2临床表型及遗传方式分析该家系发病年龄相差较大，从4岁(患者Ⅳ1开始出现周期性肢动，可能与父母关注密切相关)至38岁(患者Ⅲ6开始出现下肢不适感)。其中Ⅱ3及Ⅱ4患者为重度，Ⅱ3、Ⅱ4所在家庭，连续3代均有发病，其中男性3人，女性5人，符合常染色体显性遗传模式；但Ⅱ6号所在家庭，父母表型正常，女儿为发病表型，考虑Ⅱ6号成员为不外显表型。

2.3MassARRAYSNP检测分析该家系RLS患者未携带rs9394492-C 等位基因及rs1052553-G等位基因。该家系携带rs12469063-G等位基因、rs2300478-G等位基因、rs6710341-G等位基因、rs3923809-G等位基因、rs4714156-G等位基因、rs9357271-T等位基因、rs9296249-C等位基因、rs1026732-A等位基因、rs11635424-G等位基因、rs12593813-G等位基因、rs3784709-T等位基因、rs4489954-T等位基因、 rs6494696-C等位基因、rs884202-G等位基因、rs1975197-A等位基因、rs4626664-A等位基因携带者均存在发病与不发病两种表型，表示这些SNP均与该家系RLS患者无共分离，考虑与本家系发病无关。其中MAP2K5基因所检测的rs3784709、rs4489954、rs6494696、rs884202、rs1975197位点与患者基因型均一致，而4名正常人中出现两种不同基因型，但考虑两名携带与患者相同基因型的正常成员年龄较小(15岁及39岁)，不能除外年龄原因未发病可能。具体见表2。

注：：正常男性；：正常女性；：男性患者；：女性患者；：先证者；：死亡者 图1 RLS家系图谱

表2 RLS家系中接受基因检测者的临床表现及部分基因位点检测情况

注：—：未检出

2.4单体型分析基于SNPs基因分型结果及家系图，Ⅱ2号、Ⅱ3号、Ⅲ1号、Ⅲ2号及Ⅳ1号家庭成员位点基因分型完整，利用此家庭做单体型分析，分析包含多个SNP位点的基因。

2.4.1MEIS1基因：该基因3个SNPs分布如图2所示，该家庭所有RLS患者可能均携带Ⅱ3号个体ATA染色体(黄条)，这提示MEIS1基因可能与该家系发病有关。

注：：正常男性；：正常女性；：男性患者；：女性患者；：先证者；：死亡者 图2 MEIS1基因RLS单体型家系图

2.4.2BTBD9基因：该基因5个SNPs分布如图3所示，该家庭RLS患者Ⅲ2号患者未携带与Ⅱ3号患者黄色GTCTT染色体，说明Ⅲ2号患者及Ⅲ3患者未携带来自Ⅱ3患者的相同染色体。这提示BTBD9基因可能与该家系发病无关。

注：：正常男性；：正常女性；：男性患者；：女性患者；：先证者；：死亡者 图3 BTBD9基因RLS单体型家系图

2.4.3MAP2K 5基因：该基因7个SNPs分布如图4所示，该家庭所有RLS患者可能均携带II3号个体AAATTCG染色体(黄条)，这提示MAP2K5基因可能与该家系发病有关。

注：：正常男性；：正常女性；：男性患者；：女性患者；：先证者；：死亡者 图4 MAP2K5基因RLS单体型家系图

3 讨论

本研究根据发病程度及发病人数进行筛选后，选择了一个3代共9名患病者的家系，对其中的12人通过MassARRAY分子量阵列技术检测文献报道的可能与RLS相关的共计8个基因，20个SNPs位点，获得该家系成员不同基因相关位点基因分型，但均未发现共分离现象。之后对一家庭成员及位点基因分型完整的Ⅱ3患者家庭单元进行单体型分析，发现该家庭4名RLS患者可能均携带相同的MEI1基因及MAP2K5基因单体型，这提示MEI1基因及MAP2K5基因可能与该家系发病有关。

RLS作为一种病因未明确的，常见的神经系统感觉运动障碍性疾病，约50%的RLS患者有阳性家族史[4]。其家族聚集性的特点，使遗传学研究有着重要的意义。基于大量单一家庭的观察，有研究者提出不安腿综合征家系均遵循孟德尔常染色体显性遗传模式[1]，而对于北美77个血统的分离研究提出一种与性别作为协变量的常染色体显性遗传模式，并且发现年龄可作为一个分水岭，提出分界线为26.3岁[5]，本研究中收集的家系图显示Ⅱ3、Ⅱ4家庭，符合常染色体显性遗传模式；但Ⅱ6家庭，RLS阴性父母的女儿为RLS阳性患者，Ⅱ6成员为不外显，在家系人员病史询问过程中，Ⅱ6号成员及其家属再三否认下肢酸胀疼痛或描述不清的不适感，同时，其家属否认该成员睡眠过程中出现肢体抽动等不适。这可能意味着多种因素与RLS相关，如遗传因素、环境因素等，各因素之间可能相互作用，从而影响RLS发病与否，因此仍需纳入更多的RLS家系，对其遗传方式进一步研究观察。

既往家族连锁分析发现了多个与不宁腿相关的遗传位点，包括12q13-23(RLS1)、14q13-21(RLS2)、9p24-22(RLS3)、2q33(RLS4)、20p13(RLS5)等。全基因组SNP关联分析是近年来逐渐发展成熟的高通量遗传分析技术，基于此技术的研究发现MAOA、MEIS1、BTBD9、MAP2K5/LBXCOR1、PTPRD、NOS1等基因可能增加RLS患病风险[1]。亚洲地区关于RLS的研究相对较少，数量有限的来自韩国、国内的研究也发现亚洲RLS患者与BTBD9、MEIS1、MAP2K5及PTPRD相关[6-9]，但均未针对原发性RLS家系进行研究，尚未发现不同基因与特定的临床表现之间的关联。MEIS1属于Meis同源框家族成员之一，其活动与铁代谢相关，对于神经嵴的发育有重要作用，在脑组织表达广泛[10]。MAP2K5编码有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase)，与细胞增殖及肌细胞分化有关。MAP2K5所在的ERKs信号通路在保护多巴胺能神经元上有重要作用[11]。

本研究家系来自国内，结果发现MEI1、MAP2K5基因可能与该RLS家系发病有关，这一结果与国内外既往RLS相关遗传学研究基本一致。但已检测的SNPs均未发现共分离现象，这提示这些基因上可能存在其他位点影响这一疾病的发生，未来尚需要进一步研究来探索，也可能亚洲RLS家系存在某些特定的遗传位点，更多国内RLS的研究有助于探索亚洲RLS家系的遗传异质性，扩展RLS基因库，从而进一步揭示RLS的发病机制。本研究未发现BTBD9、PTPRD等基因与该家系RLS发病相关，其可能原因为本研究仅基于一个单一家系，不同家系可能存在不同致病相关位点可能，未来需要更多基于RLS家系的研究来证实这一点。此外，本研究选取20个已知的可能和RLS相关的SNPs位点进行检测，随着未来更多位点的发现，基因筛查的阳性率可能会提高。