高乌头炮制品不同溶剂萃取部分HPLC多波长指纹图谱研究

李芸 张立军 戴海蓉 杨志军 马冬妮 杨秀娟 马骏 苗小楼

摘要：目的  将均谱法用于高乌头炮制品不同溶剂萃取部分HPLC指纹图谱研究，为全面评价高乌头炮制品的质量提供参考。方法  采用系统溶剂法对不同产区高乌头炮制品95%乙醇提取物进行萃取，分别得到石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇和水6个不同溶剂萃取部分;采用HPLC于波长235、254、280、290、308 nm检测，将5个波长HPLC图谱的信号加和后求平均值作为该萃取部分的均谱;采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》对10批高乌头炮制品不同溶剂萃取部分HPLC均谱进行共有峰确认及相似度评价。结果  建立了高乌头炮制品不同溶剂萃取部分的多波长指纹图谱（MWCF），高乌头炮制品石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇及水提部分MWCF分别确定了26、35、22、17、15、25个共有峰，指认了2个指纹峰（高乌甲素和冉乌头碱）。不同产区高乌头炮制品同一极性部位MWCF相似度较高，不同极性部位的MWCF有明显差异，充分表征了有效成分在各萃取部分的分布特征。结论  本研究建立的MWCF可全面反映高乌头炮制品不同溶剂萃取部分的化学成分分布，可为高乌头炮制品的整体质量评价提供参考。

关键词：高乌头炮制品;不同溶剂萃取部分;多波长指纹图谱;均谱法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.10.015

中圖分类号：R284.1    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2018）10-0066-07

Study on HPLC Multi-wavelength Chromatographic Fingerprints of Different Extracts of Processed Aconitum Sinomontanum Nakai

LI Yun¹， ZHANG Li-jun¹， DAI Hai-rong¹， YANG Zhi-jun²， MA Dong-ni¹，YANG Xiu-juan¹， MA Jun²， MIAO Xiao-lou³

1. Department of Pharmacy， Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China; 2. Provincial-Level Key Laboratory for Tibet Herbal Chemicals and Quality Research in Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China; 3. Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences; Key Laboratory of Veterinary Pharmaceutics Discovery， Ministry of Agriculture; Key Laboratory of New Animal Drug Project of Gansu Province， Lanzhou 730050， China

Abstract： Objective To apply the mean fingerprint method （MFM） for HPLC fingerprints analysis of different extracts of processed Aconitum sinomontanum Nakai （ASN）; To provide basis for comprehensive evaluation of  quality of processed ASN. Methods Petroleum ether， chloroform， ethyl acetate， n-butanol， alcohol and water extracts were obtained by means of systematic solvent extraction from 95% ethanol extract of ASN. Each extract was determined by HPLC at wavelength of 235， 254， 280， 290， 308 nm， respectively. The signal of the HPLC spectrum ateach of the five extraction wavelengths was summed and then averaged to be the mean fingerprint of the fraction; Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM （2012 edition） was used to confirm the common peaks and evaluate the similarity in HPLC mean fingerprints of different extracts of 10 batches of ASN. Results Multi-wavelength chromatographic fingerprints （MWCF） of different extracts of ASN was established. 26， 35， 22， 17， 15 and 25 common peaks were determined in MWCF of petroleum ether， chloroform， ethyl acetate， n-butanol， alcohol， and water extracts， respectively. 2 peaks of them were identified （lappaconitine and aconitine）. The similarity of MWCF in the same polar part of processed ASN in different producing areas was high， and there are obvious differences in MWCF of different polarities， which fully characterized the distribution characteristics of active ingredients in various extraction parts. Conclusion Established MWCF for different extracts can fully reflect the distribution of chemical compositions of processed ASN， providing a reference for the comprehensive quality evaluation of processed ASN.

Keywords：processedAconitum sinomontanumNakai; different extracts; multi-wavelength chromatographic fingerprints; mean fingerprint method

高烏头为毛茛科乌头属植物高乌头Aconitum sinomontanum Nakai的根，是我国中西部地区民间习用药材，现收载于《甘肃省中药材标准》，具有祛风除湿、理气止痛、活血散瘀的功效，用于治疗风湿痹痛、关节肿痛、跌打劳伤、急慢性菌痢等^[1-2]。历代本草著作均记载“高乌头辛、苦、温，有毒”^[3-4]，使其临床应用受到限制。目前，高乌头的炮制尚无法定标准，本课题组前期对高乌头炮制工艺^[5]、炮制前后毒性^[6]及药理作用^[7]进行了系列研究，得到合理的炮制工艺，但炮制品的全面质量控制还难以实现。中药指纹图谱能够全面反映中药材及其制剂中所含化学成分种类和数量，进而反映中药材及其制剂的质量。但是，一方面由于样品处理大多采用单一溶剂进行提取，很难全面反映其化学成分信息;另一方面，紫外检测是目前指纹图谱的主要检测手段^[8]，而紫外检测波长单一，大量化学成分在非最大吸收波长处被检测导致信号很低，因此，用单一波长指纹图谱对中药同时进行整体定性和定量分析的结果具有很大片面性和随机性。本研究采用系统溶剂法依次得到高乌头炮制品6个不同溶剂萃取部分（石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇和水提部分），进行多波长检测，尽可能使每个萃取部分中重要药效物质在其最大吸收波长处得到较大的吸收，从而获得主要药效物质的专属性信号，再对多波长HPLC图谱数据求均谱，使均谱能够充分表达不同检测波长的特征信号，实现从多波长角度最大限度检测各萃取部分中化学成分信息，更好地用于高乌头炮制品的质量控制。

1  仪器与试药

BT125D型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司），KQ3200DB型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），FW-400A型高建万能粉碎机（北京科伟永兴仪器有限公司），HHS-11S型数显恒温水浴锅（上海宜昌仪器纱筛厂），1100 Series型高效液相色谱仪（美国Agilent科技有限公司，DAD检测器），SHB-3型循环水多用真空泵（郑州杜甫仪器厂），RE-5205旋转蒸发仪（上海亚荣仪器有限公司）。

高乌甲素对照品（甘肃神龙药业股份有限公司，批号20001001，纯度≥97.50%），冉乌头碱对照品（成都克洛玛生物科技有限公司，批号150404，纯度≥98.00%）;乙腈、甲醇、三乙胺、磷酸二氢钠为色谱纯，石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇为分析纯。高乌头药材分别购于甘肃、青海、西藏等地（见表1），经甘肃中医药大学药学院杨扶德教授鉴定为毛茛科乌头属植物高乌头Aconitum sinomontanum Nakai的干燥根。将原药材净制，润软，切制为约5 mm的段，自然干燥，筛去碎屑，得高乌头饮片。取饮片，用10%甘草汁（每3 mL含1 g甘草）润透，置立式压力蒸汽灭菌器内，127 ℃、0.15 MPa蒸制5 h，取出，晾干，筛去碎屑，得高乌头炮制品^[5]。

2  方法与结果

2.1  色谱条件

采用DIKMA Spursil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为0.05 mol/L磷酸二氢钠水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～10 min，4%～10%B，流速1.0 mL/min;10～23 min，10%B，流速1.0 mL/min;23～30 min，10%～25%B，流速1.0 mL/min;30～35 min，25%～30%B，流速1.0～0.6 mL/min;45～55 min，30%～35%B，流速0.6 mL/min;55～60 min，35%～50%B，流速0.6 mL/min;60～70 min，50%～60%B，流速0.6 mL/min;70～90 min，60%～80%B，流速0.6 mL/min;90～100 min，80%～100%B，流速0.6～1.0 mL/min;100～110 min，100%B，流速1.0 mL/min），检测波长分别为235、254、280、290、308 nm，柱温35 ℃，进样量10 μL。

2.2  对照品溶液的制备

精密称定冉乌头碱、高乌头甲素对照品适量，加甲醇制备浓度分别为0.296 0、0.800 4 g/L的混合对照品溶液，置于4 ℃冰箱保存，备用。

2.3  不同溶剂萃取部分供试品溶液的制备

取上述10批高乌头炮制品各500 g，通过已建立的制备方法分别制备6个不同溶剂萃取部分^[9]。分别取上述石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇和水提萃取部分浸膏质量的0.4%（出膏率分别为0.75%、0.56%、0.35%、1.09%、2.62%、23.20%），精密称定，加甲醇溶解，定容至10 mL，密塞，摇匀，进样前用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.4  不同溶剂萃取部分多波长指纹图谱的建立

2.4.1  空白溶剂考察

取甲醇，按“2.1”项下色谱条件进样分析，结果表明溶剂无干扰。

2.4.2  精密度试验

取三氯甲烷萃取部分供试品溶液（S1），按“2.1”项下色谱条件进样分析，连续进样6次，记录色谱图，并将色谱图数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》软件计算其相似度，结果相似度>0.97，表明仪器的精密度良好。

2.4.3  稳定性试验

取三氯甲烷萃取部分供试品溶液（S1），按“2.1”项下色谱条件进样，分别于0、3、6、9、12、24 h测定，记录色谱图，并将色谱图数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》软件计算其相似度，结果相似度>0.96，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.4  重复性试验

取同一批次样品粉末（S1），按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图，并将色谱图数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》软件计算其相似度，结果相似度>0.94，表明本法重复性良好。

2.4.5  多波长指纹图谱建立与共有峰标定

取10批高乌头炮制品不同溶剂萃取部分供试品溶液共60份（每批6份），按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录色谱图。选择色谱峰信息最丰富的5个波长（235、254、280、290、380 nm）为匹配基准，实现同一成分在不同波长检测到的指纹峰完成匹配，若某成分不出峰则积分以0计算，将高乌头炮制品每个萃取部分5个波长的HPLC图谱数据信号加和后求平均值作为该部分的均谱。将每个溶剂萃取部分的10批均谱数据导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》软件，采用中位数矢量法进行多点校正，生成高乌头炮制品不同溶剂萃取部分多波长指纹图谱（MWCF）及对照指纹图谱（R），以克服单波长检测获得的药物相关物质信息量缺失和检测结果不准确的缺点^[10-11]。各溶剂萃取部分MWCF共有峰数目及峰的归属结果见表2。混合对照品图谱见图1，5个不同波长10批高乌头炮制品6个极性部分的HPLC图谱、MWCF指纹图谱共有模式分别见图2～图7。每批高烏头炮制品非共有峰总面积与总峰面积的比值均小于10%，符合指纹图谱技术要求。

2.4.6  多波长指纹图谱相似度评价

通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）》分析处理，生成高乌头炮制品指纹图谱共有模式，得到相似度评价结果。相似度可体现不同批次样品之间各成分在种类和相对含量上的相似程度;由于相似度不能反映不同批次样品间成分绝对含量的差异，所以同时采用总峰面积比（样品总峰面积/10批样品平均总峰面积）和相似度2个指标共同来对样品进行评价^[12]。10批高乌头炮制品石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇和水提部分相似度评价结果见表3～表8。不同溶剂萃取部分的相似度均大于0.80，表明各批次样品之间具有较高的相似性;各批次之间总峰面积比不同，表明样品中的成分含量可能受药材产地、采集时间的影响。

3  讨论

本试验曾采用甲醇-水系统作为流动相，多种梯度洗脱，高乌头样品中大部分化学成分能够较好分离，但在波长254 nm时基线漂移较为严重，而换用乙腈-水作为流动相效果较好;另外，高乌甲素和冉乌头碱结构相似，极性相近，很难达到基线分离，本试验分别考察了加三乙胺、磷酸二氢钠等缓冲盐，结果显示采用磷酸二氢钠-乙腈系统时稳定且分离效果良好;同时，本试验对色谱柱、柱温、波长等进行考察，最终筛选了色谱峰信息较丰富的5个波长（235、254、280、290、308 nm），建立了在同一色谱条件下对高乌头炮制品不同极性部位化学成分分析的最佳色谱条件。

目前大部分中药指纹图谱研究仅考察了单一极性部分的指纹图谱，或单一波长的指纹图谱，忽略了不同极性成分之间的差别，以及不同药效成分由于结构不同而造成最大吸收不同的影响。本研究采用多波长求均谱的方法建立了高乌头炮制品不同极性部位的MWCF，从2个方面综合评价高乌头炮制品的质量。通过对比高乌头炮制品6个不同溶剂萃取部分MWCF共有模式可清晰观察到，不同极性部分的化学成分种类不同，且每个极性部位间化学成分含量差异明显。植物类药材由于生长环境、气候、土壤、采集时间等因素的影响，其成分种类和含量也有所不同，表现在色谱图中则是色谱峰的数目、保留时间，以及相同保留时间色谱峰峰面积的差异。通过对各极性部分的相似度分析可以看出，不同产区高乌头炮制品同一极性部分所含化学成分数量及含量也存在一定差异，其中石油醚、乙酸乙酯、乙醇及水提部分较为突出，相似度在0.65以上。不同极性部位之间化学成分有明显差异，除石油醚、三氯甲烷、水提部分含高乌甲素和冉乌头碱外，其余3个萃取部分均不含高乌甲素和冉乌头碱;三氯甲烷萃取部分MWCF的共有峰最多，化学成分最丰富，主要含有生物碱，其中高乌甲素和冉乌头碱含量最高^[9]，其次为石油醚、乙酸乙酯和水提部分，正丁醇与乙醇部分共有峰最少。MWCF更全面地展示了高乌头炮制品不同极性部分化学成分的分布。

高乌头辛、苦、温，有毒，通过甘草汁炮制后毒性明显降低，镇痛抗炎作用有增强趋势，但毒性与药效成分尚不十分明确。本课题组今后将通过急性毒性实验、长期毒性实验及镇痛抗炎实验评价高乌头各极性部分毒性特征与药效特征，采用灰色关联分析方法和相关性分析方法计算指纹图谱共有峰与半数致死量、最大给药量及药效指标的关联度^[13]，以关联度的大小衡量各指纹图谱共有峰对毒性及对镇痛抗炎作用的贡献大小，确定主要毒性成分及镇痛抗炎成分，揭示高乌头毒性物质基础与药效物质基础，为高乌头的炮制加工及临床应用研究提供依据。

参考文献：

[1] 甘肃省食品药品监督管理局.甘肃省中药材标准[M].兰州：甘肃文化出版社，2009：117-118.

[2] WANG Y Z， XIAO Y Q， ZHANG C， et al. Study of analgesic and anti-inflammatory effects of lappaconitine gelata[J]. J Tradit Chin Med，2009，29（2）：141-145.

[3] 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草：第七卷[M].上海：上海科学技术出版社，1999：1746-1747.

[4] 江苏新医学院.中药大辞典：下册[M].上海：上海科学技术出版社， 2001：751-752.

[5] 李芸，胡昌江，侯桃霞，等.正交实验优选高乌头解毒的炮制工艺研究[J].中成药，2015，37（4）：905-909.

[6] 李蕓，胡昌江，徐婷，等.高乌头炮制前后高乌甲素含量测定及小鼠急性毒性实验[J].中成药，2016，38（1）：179-181.

[7] 张立军，戴海蓉，李芸，等.高乌头炮制前后毒性部位与镇痛抗炎药效部位筛选研究[J].中药药理与临床，2017，33（4）：78-82.

[8] 清华大学.多波长中药色谱指纹图谱及其构建方法与应用：CN1544935[P].2004-11-10.

[9] 张立军，戴海蓉，杨志军，等.高乌头炮制前后镇痛抗炎活性部位HPLC指纹图谱建立及质量研究[J].中草药，2017，48（12）：2442-2447.

[10] 孙国祥，车磊，李闫飞.一种评价多波长中药色谱指纹图谱新方法-均谱法[J].中南药学，2011，9（7）：533-538.

[11] 孙国祥，吴波，毕开顺.平行五波长高效液相色谱指纹图谱全息整合法定量鉴定杞菊地黄丸的整体质量[J].色谱，2010，28（9）：877-884.

[12] 张立军，戴海蓉，樊秦，等.不同产地高乌头药材HPLC指纹图谱及2种生物碱成分含量测定[J].中国实验方剂学杂志，2017，23（17）：41-46.

[13] 邓聚龙.灰色系统基本方法[M].武汉：华中理工大学出版社，1987：33-84.