百草枯所致肺纤维化患者Ⅱ型肺泡表面抗原6粘糖蛋白与肺泡表面活性蛋白A、D及白介素6的相关性研究

王 英，刘 敏，于波涛，王敬东

百草枯是一种非选择性接触型除草剂，因其除草效能高而在我国农业生产中普遍应用。百草枯进入人体后可迅速进入各循环系统并对多种器官造成不同程度损伤［1-2］。肺部是百草枯主要靶器官之一，而肺泡上皮细胞可摄取大量百草枯并蓄积在肺组织，因此肺组织中百草枯浓度是血液的数十倍以上［3］。研究表明，百草枯可通过诱导肺成纤维细胞及肺上皮细胞转分化为肌成纤维细胞并导致细胞外基质沉积，造成肺泡壁厚度增加并对肺泡结构产生影响，最终引发肺纤维化［4-5］。目前，临床上主要采用免疫抑制剂及抗氧化剂治疗百草枯所致肺纤维化，但整体治疗效果较差［6-8］，因此积极寻找新的治疗靶点以提高百草枯所致肺纤维化患者治愈率具有重要临床意义。本研究旨在探讨百草枯所致肺纤维化患者Ⅱ型肺泡表面抗原6（KL-6）粘糖蛋白与肺泡表面活性蛋白A（SP-A）、肺泡表面活性蛋白D（SP-D）及白介素6（IL-6）的相关性，为百草枯所致肺纤维化患者治疗靶点研究提供参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 诊断标准 百草枯所致肺纤维化患者早期（3 d～1周）主要表现为肺纹理增多，肺野毛玻璃样改变甚至双肺广泛高密度影，“白肺”形成，肺实质改变或小囊肿等；中期（1～2周）主要表现为肺大片实变，肺泡结节及部分肺纤维化；后期（2周后）主要表现为局限性或弥漫性网状纤维化、低氧血症。

1.2 一般资料 选取2016年6月—2017年2月青岛市中心医院收治的百草枯所致肺纤维化患者65例作为观察组，排除标准：（1）存在免疫缺陷性疾病者；（2）存在恶性肿瘤者；（3）中毒至入院时间＞2 h者；（4）既往有肺、肝、肾等脏器疾病者；（5）临床资料不完整者；（6）合并其他药物中毒者；（7）入组前服用过免疫抑制剂、免疫增强剂者。另选取同期在青岛市中心医院体检健康志愿者30例作为对照组。两组患者性别、年龄、体质量比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见表1），具有可比性。本研究经青岛市中心医院医学伦理委员会审批通过，所有受试者或其家属签署知情同意书。

表1 两组患者一般资料比较Table1 Comparison of general information between the two groups

1.3 方法

1.3.1 血清KL-6粘糖蛋白水平检测方法 抽取两组受试者清晨空腹静脉血3 ml，4 000 r/min离心10 min（离心半径13 cm），留取上清液1 ml并置于-20 ℃冰箱保存待测；采用化学发光酶免疫检测法检测血清KL-6粘糖蛋白水平，具体如下：将稀释后血清标本及KL-6粘糖蛋白校准液分注入含KL-6抗体的抗体结合粒子溶液（250 μl），混匀后37 ℃孵育10 min，去除反应液、洗净后加入碱性磷酸酶标记抗体250 μl，37 ℃孵育10 min，再次去除反应液、洗净后加入底物200 μl，混匀后37 ℃反应5 min，测定波长477 nm处发光强度最大条带即为血清KL-6粘糖蛋白水平。KL-6粘糖蛋白试剂盒购自富士瑞必欧株式会社并严格按照说明书进行操作，所用仪器为LUMI PULSE G1200全自动免疫分析仪，并设置复孔取均值。

1.3.2 血清SP-A、SP-D、IL-6水平检测方法 抽取两组受试者清晨空腹静脉血3 ml，3 500 r/min离心10 min（离心半径13 cm），留取上清液1 ml并置于-80 ℃冰箱保存待测；采用酶联免疫吸附试验检测血清SP-A、SP-D、IL-6水平，具体如下：首先将抗人SP-A抗体包被于酶标板上，标准品或血清标本中SP-A与包被抗体结合后洗去游离成分，按顺序加入生物素化的抗人SP-A抗体及辣根过氧化物酶标记的亲和素，抗人SP-A抗体与结合在包被抗体上的人SP-A结合后形成免疫复合物，洗去游离成分并加入显色底物，在辣根过氧化物酶的催化下显色底物变为蓝色，加入终止液后显色底物变为黄色，采用酶标仪测定450 nm波长处光密度（OD）值并通过绘制标准曲线计算血清SP-A水平。血清SP-D、IL-6水平检测原理、步骤及计算方法同血清SP-A水平，试剂盒均购自伊莱瑞特生物科技有限公司并严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量资料以（）表示，组间比较采用两独立样本t检验；计数资料分析采用χ2检验；百草枯所致肺纤维化患者血清KL-6粘糖蛋白水平与血清SP-A、SP-D、IL-6水平的相关性分析采用Pearson相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清KL-6粘糖蛋白、SP-A、SP-D、IL-6水平观察组患者血清KL-6粘糖蛋白、SP-A、SP-D、IL-6水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2）。

2.2 相关性分析 Pearson相关分析结果显示，百草枯所致肺纤维化患者血清KL-6粘糖蛋白水平与血清SP-A（r=0.573）、SP-D（r=0.466）、IL-6（r=0.521）水平均呈正相关（P＜0.05）。

表2 两组受试者血清KL-6粘糖蛋白、SP-A、SP-D、IL-6水平比较Table2 Comparison of serum levels of KL-6 mucoprotein，SP-A，SP-D and IL-6 between the two groups

表2 两组受试者血清KL-6粘糖蛋白、SP-A、SP-D、IL-6水平比较Table2 Comparison of serum levels of KL-6 mucoprotein，SP-A，SP-D and IL-6 between the two groups

注：KL-6=Ⅱ型肺泡表面抗原6，SP-A=肺泡表面活性蛋白A，SP-D=肺泡表面活性蛋白D，IL-6=白介素6

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3 讨论

百草枯中毒可累及多个脏器，严重时可导致多器官功能障碍综合征（MODS）。肺脏是百草枯主要靶器官之一，百草枯中毒后可形成“百草枯肺”，早期表现为急性肺损伤（ALI）或急性呼吸窘迫综合征（ARDS），后期则出现肺泡内和肺间质纤维化，而百草枯所致肺纤维化患者病死率为50%～70%［9-10］。肺出血、水肿、肺部间质炎症、胶原合成及成纤维细胞增殖是百草枯所致肺纤维化的主要病理特征［11］，但目前百草枯导致肺纤维化的具体机制尚不完全明确，氧自由基造成的直接损伤及成纤维细胞、炎性细胞造成的间接损伤可能是百草枯导致肺纤维化的主要原因［12］。

KL-6粘糖蛋白分子量较大，是黏蛋白1（MUC1）家族成员之一［13］。KL-6粘糖蛋白主要在Ⅱ型肺泡上皮、胰腺及乳腺导管组织中表达，其中Ⅱ型肺泡上皮中KL-6粘糖蛋白表达水平较高。研究表明，KL-6粘糖蛋白可促进成纤维细胞产生胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ并诱导成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，促进α平滑肌肌动蛋白生成及上皮-间质转变，诱导大量细胞外基质成分产生［14-15］；KL-6粘糖蛋白对特发性肺纤维化有一定诊断价值并可在一定程度上判断疾病的严重程度［16］，但目前关于百草枯中毒所致肺纤维化患者KL-6粘糖蛋白的临床意义研究较少见。本研究结果显示，观察组患者血清KL-6粘糖蛋白水平高于对照组，提示血清KL-6粘糖蛋白水平可作为诊断百草枯所致肺纤维的参考指标，分析百草枯所致肺纤维化患者血清KL-6粘糖蛋白水平升高机制如下：百草枯中毒导致基底膜损伤及Ⅱ型肺泡上皮细胞含量增加，KL-6粘糖蛋白分泌随之增多并释放入肺泡衬褶，肺泡衬褶损伤及血管通透性增加导致KL-6粘糖蛋白释放入血而引起血清中KL-6粘糖蛋白水平升高［17-19］。

肺泡表面活性蛋白属亲水性大分子物质，主要来源于肺泡Ⅱ型上皮细胞，包括A、B、D等多种亚型，其中SP-A、SP-D表达量占该类蛋白总表达量的一半以上［20］。正常情况下，SP-A、SP-D无法通过肺组织血气屏障而进入血液循环，因此健康人血清SP-A、SP-D水平较低。既往研究表明，肺纤维化大鼠血清白介素4（IL-4）及SP-A水平明显高于正常大鼠，且肺纤维化程度越重，血清IL-4及SP-A水平越高［21-22］；不同阶段肺纤维化大鼠血清SP-D水平均高于正常大鼠，且血清SP-D水平随肺纤维化程度加重而升高［16，22-23］。本研究结果显示，观察组患者血清SP-A、SP-D水平高于对照组，与上述研究结果一致，分析其主要原因与肺泡Ⅱ型上皮细胞分泌肺泡表面活性蛋白增多、肺组织血气屏障遭破坏而导致SP-A、SP-D进入血液循环有关。

有研究表明，百草枯进入体内后可通过脂质过氧化物损伤组织细胞并引发应激反应，刺激白介素1（IL-1）、IL-6及肿瘤坏死因子α等炎性递质大量释放，继而导致巨噬细胞、中性粒细胞等浸润、聚集并进一步促进炎性递质及细胞因子释放，造成组织损伤加重［24-26］。IL-6主要由血管内皮细胞及单核细胞分泌产生，具有广泛的生物学效应，血清IL-6水平升高不仅会对血管内皮细胞造成直接损伤，还可能催化、放大炎性反应并进一步加重血管内皮细胞。本研究结果显示，观察组患者血清IL-6水平高于对照组，分析原因可能与百草枯导致肺纤维化过程中大量增生的巨噬细胞、淋巴细胞、成纤维细胞分泌大量IL-6有关［27-28］。本研究结果还显示，百草枯所致肺纤维化患者血清KL-6粘糖蛋白水平与血清SP-A、SP-D、IL-6水平均呈正相关，提示KL-6粘糖蛋白可作为诊断百草枯所致肺纤维化的参考指标，这也为百草枯所致肺纤维化的治疗提供了新的靶点。

综上所述，百草枯所致肺纤维化患者血清KL-6粘糖蛋白、SP-A、SP-D、IL-6水平明显升高，且血清KL-6粘糖蛋白水平与血清SP-A、SP-D、IL-6水平呈正相关，KL-6粘糖蛋白可作为诊断百草枯所致肺纤维化的参考指标及治疗靶点；但本研究样本量较小且观察指标较少，结果结论尚需扩大样本量进一步研究证实。

作者贡献：王英进行试验设计与实施、资料收集整理、撰写论文并对文章负责；刘敏、于波涛进行试验实施、评估、资料收集；王敬东进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。