急性冠脉综合征患者血清骨髓相关蛋白水平、外周血单个核细胞Toll样受体4表达情况及其相关性研究

刘贵京，施海法，张素华，王晓利，范晓飞，康美玉，呼金田，燕 霞

动脉粥样硬化以动脉壁炎性改变为主要特征，其中炎性反应不仅在动脉粥样硬化斑块形成过程中发挥重要作用，还影响斑块稳定性［1］。骨髓相关蛋白（myeloid related proteins，MRP）是钙结合蛋白S100家族成员，主要通过钙离子依赖性方式形成特殊的异二聚体MRP8/MRP14而发挥作用。近年研究发现，MRP8/MRP14蛋白复合体能作为特异性配体与Toll样受体4（TLR4）结合，刺激单核细胞分泌炎性因子，引发一系列炎性反应，进而参与冠状动脉不稳定斑块形成［2-3］。Toll样受体（TLRs）是一类模式识别受体，可介导免疫炎性反应，是连接先天性免疫和获得性免疫的桥梁。既往研究结果显示，TLR4是与动脉粥样硬化关系最为密切的TLRs之一，其主要通过识别内源性和外源性分子而启动炎性反应［4］。本研究旨在探讨急性冠脉综合征（ACS）患者血清MRP水平、外周血单个核细胞TLR4表达情况及其相关性，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2015年3月—2016年3月河北工程大学附属医院心内科收治的ACS患者50例，均经冠状动脉造影确诊，其中急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）25例（AMI组）、不稳定型心绞痛（unstable angina pectoris，UAP）25例（UAP组）；另选取同期稳定型心绞痛（stable angina pectoris，SAP）患者20例作为SAP组，体检健康者24例作为对照组。4组受试者年龄、男性比例、体质指数（BMI）及吸烟率比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见表1），具有可比性。排除标准：（1）合并急性感染、恶性肿瘤、自身免疫系统疾病者；（2）合并严重肝、肾功能障碍者；（3）近1周内有创伤史或手术史者。本研究经河北工程大学附属医院伦理委员会审核批准，所有受试者知情。

1.2 观察指标

1.2.1 血压、血糖相关指标及血脂指标 常规测量4组受试者收缩压、舒张压，采用全自动生化分析仪（西门子Siemens公司生产，型号：ADVIA 2400）检测4组受试者空腹血糖、糖化血红蛋白（HbA1c）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白（HDL）及低密度脂蛋白（LDL）。

表1 4组受试者一般资料比较Table1 Comparison of general information in the four groups

1.2.2 血清MRP水平 采集4组受试者静脉血2 ml，2 000 r/min离心15 min（离心半径8 cm），留取血清并置于-75 ℃冰箱中保存待测，采用酶联免疫吸附试验检测血清MRP水平。

1.2.3 外周血单个核细胞TLR4表达情况 采集4组受试者静脉血2 ml，采用乙二胺四乙酸二钾（EDTA-K2）抗凝处理，在Ficoll密度梯度离心管中制备外周血单个核细胞。以5×106个细胞/ml浓度将细胞重悬于Stain Buffer（pH值为7.4的磷酸缓冲液+2%小牛血清+0.1%叠氮钠），采用固定液和破膜液处理，后1 000 r/min离心5 min（离心半径8 cm），弃上清；采用3 ml Stain Buffer清洗细胞3遍，将细胞重悬于Stain Buffer，使细胞终浓度为10×106个细胞/ml。取100 μl细胞悬液（10×106个细胞/ml）置于BD试管中，加入5 μl PE标记鼠抗人TLR4单抗（美国BD公司生产）混匀后室温避光孵育60 min。采用3 ml Stain Buffer清洗细胞1遍，细胞沉淀用500 ml Stain Buffer重悬后上流式细胞仪（美国 BD公司）检测外周血单个核细胞TLR4阳性率。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计量资料以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验；计数资料分析采用χ2检验；血清MRP水平与ACS患者外周血单个核细胞TLR4阳性率的相关性分析采用Pearson相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血压、血糖相关指标及血脂指标 4组受试者舒张压、空腹血糖、HbA1c、HDL及LDL比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。4组受试者收缩压及TG比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；UAP组和AMI组患者收缩压及TG高于对照组和SAP组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2）。

2.2 血清MRP水平和外周血单个核细胞TLR4阳性率4组受试者血清MRP水平和外周血单个核细胞TLR4阳性率比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；UAP组和AMI组患者血清MRP水平和外周血单个核细胞TLR4阳性率高于对照组和SAP组，差异有统计学意义（P＜0.05）；对照组与SAP组、UAP组与AMI组受试者血清MRP水平和外周血单个核细胞TLR4阳性率比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见表3）。

2.3 相关性分析 Pearson相关分析结果显示，血清MRP水平与ACS患者外周血单个核细胞TLR4阳性率呈正相关（r=0.796，P＜0.01）。

表3 4组受试者血清MRP水平和外周血单个核细胞TLR4阳性率比较（）Table3 Comparison of serum MRP level and PBMC TLR4 positive rate in the four groups

表3 4组受试者血清MRP水平和外周血单个核细胞TLR4阳性率比较（）Table3 Comparison of serum MRP level and PBMC TLR4 positive rate in the four groups

注：MRP=骨髓相关蛋白，TLR4=Toll样受体4；与对照组比较，aP＜0.05；与SAP组比较，bP＜0.05

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表2 4组受试者血压、血糖相关指标及血脂指标比较（）Table2 Comparison of blood pressure，blood glucose related index and blood lipid index in the four groups

表2 4组受试者血压、血糖相关指标及血脂指标比较（）Table2 Comparison of blood pressure，blood glucose related index and blood lipid index in the four groups

注：HbA1c=糖化血红蛋白，TG=三酰甘油，HDL=高密度脂蛋白，LDL=低密度脂蛋白；与对照组比较，aP＜0.05；与SAP组比较，bP＜0.05

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3 讨论

ACS是冠状动脉不稳定斑块破裂导致不同程度血栓形成引起的血管狭窄或闭塞，其发生机制较为复杂［5］。近年来研究表明，免疫炎性反应在斑块易损性方面具有重要作用［6-7］。MRP又称为钙卫蛋白，是由MRP8和MRP14组成的异二聚体，其主要表达于有核细胞，是巨噬细胞激活的标志物。既往研究表明，巨噬细胞激活后MRP8和MRP14迅速结合形成MRP8/MRP14异二聚体，进而改变细胞结构和细胞膜位置，加速其分泌［8-9］。MRP8/MRP14具有广泛的生物学功能，能被特异性地分泌至炎性病灶处，进而参与炎性反应［10］。既往研究表明，MRP能通过损伤内皮细胞骨架蛋白和连接蛋白而导致内皮细胞通透性增加，进而导致内皮细胞功能紊乱；此外，其还能促进内皮细胞血小板反应蛋白表达，诱导血小板黏附和血栓形成，进而参与动脉粥样硬化不稳定斑块形成［11］。近年研究发现，MRP8/MRP14可作为TLR4特异性配体而参与炎性反应［4］。LOSER等［12］研究表明，MRP8/MRP14激活TLR4炎症信号级联反应，并通过FAT/CD36依赖机制释放炎性因子，进而参与炎性反应。YONEKAWA等［13］研究发现，MRP8/MRP14作为特异性配体与TLR4结合，刺激单核细胞分泌炎性因子并引发一系列炎性反应，进而参与冠状动脉不稳定斑块形成。TLRs是介导天然免疫反应的模式识别受体，在炎症和免疫应答过程中具有重要作用。截至目前，TLRs 13个家族成员中TLR4与心血管疾病关系最为密切。TLR4可导致核因子κB（NF-κB）激活，诱导肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）等炎性因子释放并启动炎性应答［14］。

本研究结果显示，UAP组和AMI组患者血清MRP水平高于对照组和SAP组，提示ACS患者血清MRP水平升高；但对照组与SAP组、UAP组与AMI组受试者血清MRP水平间无差异，推测MRP可能是导致冠状动脉粥样硬化斑块不稳定的重要因素之一。本研究结果还显示，UAP组和AMI组患者外周血单个核细胞TLR4阳性率高于SAP组和对照组，提示ACS患者外周血单个核细胞TLR4表达升高；但对照组与SAP组、UAP组与AMI组受试者外周血单个核细胞TLR4阳性率间无差异，推测外周血单个核细胞TLR4表达可能是导致冠状动脉粥样硬化斑块不稳定的重要因素之一。进一步分析血清MRP水平与外周血单个核细胞TLR4阳性率关系发现，血清MRP水平与ACS患者外周血单个核细胞TLR4阳性率呈正相关，提示MRP可能通过激活TLR4而参与ACS的发生、发展。

综上所述，ACS患者血清MRP水平及外周血单个核细胞TLR4表达升高，且二者呈正相关，推测MRP可能通过激活TLR4而参与ACS的发生、发展，这可能为ACS的研究及治疗提供新的思路。但本研究为单中心研究，样本量较小，且研究结果受现有医疗设备及技术水平影响，故存在一定局限性。

作者贡献：刘贵京进行文章的构思与设计，研究的实施与可行性分析，负责文章的质量控制及审校，对文章整体负责、监督管理；施海法、张素华、康美玉、呼金田进行数据收集、整理、分析；燕霞进行结果分析与解释；王晓利、范晓飞负责撰写论文。

本文无利益冲突。