禽大肠杆菌的分离与耐药性的检测

王晓姗，李斯亮

(临泽县动物卫生监督所，甘肃 张掖 734200)

致病性大肠杆菌是人类和动物临床上最常见的病原之一 ，是威胁人类和动物健康的重要致病菌。近些年，由于抗生素的滥用，细菌对药物的耐药性逐渐增加，并且大多数显示出复杂的耐药机制，尤其抗生素耐药基因的出现更进一步导致病菌的耐药性的传播和遗传。禽大肠杆菌血清型 (群)比较复杂，且变异性较强，很难用疫苗得到有效的预防，并且对抗生素容易产生耐药性，在临床防治工作中，要取得较好的治疗效果，就需要选择对大肠杆菌比较敏感的药物，来进行预防与治疗，才能达到控制该病的目的。本文针对这一方面作了有益的探讨。

1 材料

1.1 病料来源

甘肃河西地区患有典型大肠杆菌病症的鸡，在其肝脏采取病料，并进行细菌培养。本试验采取了20株具有代表性的大肠杆菌病料作为试验对象，并进行进一步鉴定和筛选。

1.2 主要试剂及材料

美兰染色液、MR试剂、VP试剂、吲哚试剂、三糖铁琼脂粉、市场销售抗菌药(立服能、畅乐、杆菌速宁、髙益霉素、呼感毒菌清)、标准药敏片(甲氧苄啶、氧氟沙星、卡那霉素、庆大霉素、青霉素、诺氟沙星、氯霉素)、伊红美蓝琼脂、

2 方法

2.1 流行病学调查

详细询问疫病的发病时间、发病率和死亡率，鸡群免疫情况和发病后的治疗情况，观察临床症状和病理变化。

2.2 病料的采取

病料:采自甘肃河西部分地区具有典型肝周炎、心包炎、气囊炎的发病鸡。无菌操作，在患有典型大肠杆菌病的禽类肝脏中采取(最好用无菌镊子挑取肝脏内的部分，以防污染)。

2.3 镜检

2.3.1 涂片 在肉汤中长出细菌后，用菌液涂片法涂片，用灭菌接种环蘸取菌液1～2接种环，均匀涂抹在载玻片上，使成直径为1.5 cm左右圆形或椭圆形涂抹自然干燥。

2.3.2 染色 滴加适量的(足够覆盖抹出点即可)美兰染色液，经1～2 min,水洗，沥去多余的水分，吸干(烘干，不能太热)，然后镜检。

2.4 细菌的增殖培养

将采取的病料无菌操作接入肉汤培养基中，封紧试管口，放入揺床中，保持37℃的温度下培养，培养24 h后取出，观察，放置在4℃的冰箱中保存。每只患病禽的病料接一个试管，并编号。

2.5 细菌的纯化培养

采用划线接种法，在无菌台上，将已培养好的细菌划线接种在伊红美兰琼脂平板上，并放入37℃的恒温箱内培养16～24 h。

2.6 单个菌落的挑取

在无菌台上，挑取伊红美兰琼脂平板上生长的具有黑色带金属光泽的单个菌落，接种于肉汤培养基中，并在37℃的摇床中培养。

2.7 细菌的生化试验

在无菌台上，分别钓取十种菌的纯培养物(灭一种菌接一试管生化试剂)，接种于半固体糖培养基(三糖铁)中培养，观察固体培养基的颜色变化及产生气体情况；液体培养基做糖类、MR、VP、吲哚试验；做好标记后，放入37℃的恒温箱中培养，在一周之内观察结果。切记：钓菌环在钓取每一种菌液后要灭菌，以防交叉感染。接种时先涂布斜面后穿布斜面，后穿刺底层置24℃恒温箱中培养24 h,取出后观察反应情况，根据结果进行细菌种属判定。

2.8 药敏试验

本试验采用的是纸片扩散法：用灭菌棉拭子分别蘸取鉴定过的并且已确定的大肠杆菌菌液，在管壁将多余的菌液挤去后，在琼脂平板表面涂布3次，每次旋转60度，最后在平板内缘涂抹一周，务必使菌液能均匀，经室温3～5 min后，用无菌小镊子将上述药敏试纸贴于平板表面(每换一张纸片都要灭菌一次镊子)，并轻压紧贴在平板表面，药敏试纸一旦接触平板就不要在移动，然后置于37℃培养过夜(16 h左右)后取出观察结果。一般直径90.0 mm的平皿可贴6张药敏纸片，各纸片中心距离相距应大于24 mm，纸片距离平板内缘应大于15 mm。

判定标准：按抑菌圈直径大小作为敏感性高低的标准。抑菌圈直径越大表明细菌对该药的敏感性越高。抑菌圈直径 15.1～20 mm者为高敏度敏感；直径10.1～15 mm者为中度敏感；直径在10 mm以下者为低度敏感。

3 试验结果及分析

3.1 调查情况

养殖户大都来自甘肃河西地区，普通肉鸡和蛋鸡较多，很少发现有其它品种鸡，大致都在15～30日龄左右；据了解，养殖户在日常情况下饲喂小鸡时会拌点抗生素来防治病的发生，或者普通一些病再不了解的情况下也会用抗生素，若经常使用抗生素，这无疑造成对某些抗生素产生耐药性。

3.2 细菌的形态特征

培养物涂片后，美兰染色后镜检，为粗短两端钝圆的小杆菌，多单个散在存在，个别成双排列，无芽胞。

3.3 培养结果

已选择的具有代表性的20株菌液，经 37℃培养24～48 h，20株均能在普通营养肉汤中呈均匀混浊，管底有絮状沉淀，液面有菌环；在普通琼脂培养基上培养，形成圆形隆起、光滑湿润、中等大小灰白色菌落，直径为1.5～2.0 um的圆形菌落。

但发现10株在伊红美兰琼脂平板上培养，菌落呈黑色或黑红色带有金属光泽的圆形菌落。

3.4 生化试验

从10个伊红美兰琼脂平板上生长的呈黑色或黑红色带有金属光泽的圆形菌落，各挑取1个菌落进行增殖培养后，进行生化试验。

通过临床症状、病理变化、培养特性、分离鉴定、生化鉴定，最后确定8株为大肠杆菌。

3.5 药敏试验结果及分析

选择已确定的8株大肠杆菌和一株不确定的菌液(1号)进行药敏试验，结果(见表1)。

由表1可知，2、3、4号菌液对甲氧苄啶、氧氟沙星、卡那霉素、庆大霉素、青霉素、诺氟沙星都已经产生了耐药性，但6、7、8号菌液对氧氟沙星、卡那霉素、庆大霉素、青霉素、诺氟沙星都存在较高的敏感性(抑菌圈直径在10～15 mm之间)，建议该养殖户选取卡那霉素或者和庆大霉素、氧氟沙星、青霉素联合使用来治疗大肠杆菌病将会达到很好的效果。但是对甲氧苄啶和氯霉素已经产生了很高的耐药性，故最好不要选用此类药物

表1 药敏试验结果 mm

4 结论

大肠杆菌病，春季是高发期，并且发病鸡大致都在15～30日龄左右，大部分都出现了典型的临床症状：包心、包肝。正常情况下，大肠杆菌对多种抗生素如卡那霉素、氯霉素、甲氧苄啶等磺胺类和呋喃类药物都敏感，然而在本试验甘肃省河西地区有些养殖场存在的大肠杆菌对甲氧苄啶、氧氟沙星、卡那霉素、庆大霉素、青霉素、诺氟沙星都产生了很高的耐药性，但有些养殖场对庆大霉素和氧氟沙星较敏感，且敏感率达50%以上。本实验对有效防治大肠杆菌病有一定的参考价值，因此在临床用药时或在饲料中添加药物时要注意，不要长期大量使用这几种药物。