龙竹微波水热法制备低聚木糖的研究

王 毓，熊子灵，肖 霄，李居南

(1.新希望乳业股份有限公司 产品研发中心，成都 610041; 2.成都市华测检测技术有限公司 食药农化事业部， 成都 610041; 3.四川大学 轻纺与食品学院，成都 610065； 4.蒙牛集团 研发创新部，北京 101100)

随着人类对健康的日益重视，低聚木糖作为一种十分有潜力的益生元，目前受到广泛关注。低聚木糖是一类以木糖为基本单元、聚合度为2～10的寡糖。目前，大量研究证明低聚木糖对人体肠道益生菌的生长有良好的促进作用[1]。

低聚木糖在天然产物中的含量很低，难以提取。而农林生物质中的半纤维素组分含有大量木聚糖，是制备低聚木糖的良好原料。目前，有大量文献报道可采用玉米芯、蔗渣、杨木、小麦秸秆等为原料来制备低聚木糖[2-3]。而所用的方法主要有3种：酸水解法、酶水解法以及自水解法，其中自水解法因其不需要化学试剂的特性，以及水解后的物料可用做制备生物乙醇的原料的特性，有较多研究报道和应用[4]。自水解法也称水热处理法，它是通过水在高温高压下释放出的水合氢离子来促进生物质的水解。通过控制反应温度等条件，以达到较好的制备低聚木糖的效果。与此同时，也有相关研究报道表明，水热法制备的低聚木糖对人体肠道益生菌的体外发酵效果较酶水解低聚木糖更好[5-6]。因此，工业上越来越多地采用水热法来制备低聚木糖。微波处理是一种良好的促进化学反应的方法，在化学合成、降解等方面有较多应用。微波辅助法可以加速化学反应的进行，且其升温速率远高于传统加热方法，因此微波辅助水热处理可以加速生物质的水解，制备低聚木糖[7]。

龙竹作为一种广泛分布于中国云南地区的竹材，其产量巨大、生长迅速、成本低廉、工业利用潜力大。本研究采用微波辅助水热法、以龙竹为原料来制备低聚木糖，通过对反应温度进行控制以获取最佳反应条件，并与传统水热法进行对比。

1 材料与方法

1.1 原 料

龙竹原料于2015年采集自云南省，经80 ℃烘干后粉碎、过筛取其中40～80目的样品。分离后的竹粉样品置于索氏提取器中抽提6 h (甲苯/乙醇，体积比为2∶1)。抽提后的样品置于60 ℃烘箱中干燥6 h后，然后用80 ℃热水抽提样品4 h 以脱除所含淀粉。抽提结束后，样品经过滤后于60 ℃烘箱中干燥12 h，然后储存，备用。试验所用甲苯、乙醇等试剂均为分析纯，来自北京化工厂。

1.2 方 法

1.2.1 微波水热处理 3.0 g竹粉与去离子水在反应釜中混合(固液质量比为1∶10)后放入微波反应器进行水热反应。反应采用磁力搅拌，温度分别控制在160、170、180、190和200 ℃，反应时间为45 min，升温时间为2 min，微波加热功率为800 W，保温功率为400 W。反应结束后风冷以冷却至室温，然后对水热处理样品进行过滤，保留滤液。

1.2.2 水热处理 同样选取3.0 g竹粉以相同的固液质量比(1∶10)与去离子水在含PID温度控制器的316 L钢制批式反应器中混合。反应采用磁力搅拌，温度和时间控制在与微波辅助水热法相同的条件下来进行对比。反应结束后反应釜用自来水冷却，处理后的样品过滤并保留滤液。

1.2.3 糖分析 所制备的富含低聚木糖的液体经过0.22 μm针式过滤器过滤，然后采用配有AS50自动进样器和ED50检测器的离子色谱仪(HPAEC，ICS-3000，Dionex，美国)分析糖分。其中单糖采用Carbopac PA-20(4 mm×250 mm，Dionex，美国)色谱柱进行分析，而低聚糖则采用Carbopac PA-100(4 mm×250 mm，Dionex， 美国)色谱柱进行分析，所采用的检测方法参照文献[8]。L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、D-木糖、D-半乳糖等单糖标准品购自Sigma-Aldrich，木二糖至木六糖等5种低聚木糖标准品购自Megazyme(爱尔兰)。本研究所分析的低聚木糖得率仅针对木二糖至木六糖这5种，其他的聚合度大于6的低聚木糖因为没有标准品无法定量，因此不在本研究分析考察范围[8-9]。

1.2.4 降解产物和分子量分析 水解制备的液体样品经0.22 μm针式过滤器过滤后采用配有HPX-87H (7.8 mm×300 mm,Bio-Rad Laboratories,美国)色谱柱的高效液相色谱仪(GPC,Agilent 1200,Agilent Technologies,美国)分析检测所含的糖降解产物，流动相为5 mmol/L H2SO4，速率为0.6 mL/min。

样品的分子量分析通过装备有PLaquagel-OH 50凝胶色谱柱的 (7.7×300 mm，Polymer Laboratories Ltd.，美国)的凝胶色谱仪(GPC,Agilent 1200,Agilent Technologies,美国)进行检测，具体方法参见文献[7]。

2 结果与分析

2.1 低聚木糖的制备

原料的具体成分参见文献[4]，其中半纤维素(木聚糖)含量为21.6%，包含阿拉伯糖(0.8%)、半乳糖(0.2%)、甘露糖(0.1%)、葡萄糖醛酸(0.1%)、乙酰基(2.2%)和木糖(18.2%)[4]。

微波辅助法和水热法降解龙竹粉制备低聚木糖在160、170、180、190和200 ℃下分别反应45 min，所得的低聚木糖的产率如图1所示。从图1不难发现，不论是微波辅助法还是传统的水热法，它们均在反应温度为180 ℃时获得最高得率，这与之前文献报道结果相似[8,10]。此时，微波辅助法的低聚木糖得率为31.4%，而水热法的得率为27.8%，由此可见在最佳反应条件下微波辅助法有更好的效果。这样的结果可能是由于微波加热的特性而导致的，其原理是极性分子在高频电磁场作用下极性取向改变，引起分子的热运动和分子间相互作用，将微波场的场能转化为热能[11]。因此微波加热的升温速率和加热效果较传统加热方法优势明显，在处理生物质原料时可以深入原料内部加热，使温度瞬时升高，从而导致原料结构快速裂解。图2为微波处理和水热处理的升温曲线，不难发现微波加热到设定的温度仅需2 min，而普通水热法加热到设定的反应温度需要长达40 min的加热期。同时，由于微波加热可以深入反应物料内部加热，因此其加热效率更高，所以在180 ℃时其低聚木糖得率也较水热处理法高。而且，在较低温度如160、170 ℃时，其低聚木糖的产率也比水热法在相同温度下的高。与此同时，微波处理整个反应所需时间仅为47 min(升温2 min，保温45 min)，而水热处理法则需要85 min(升温40 min，保温45 min)。因此，微波处理法制备低聚木糖的效率较传统的水热处理有明显提高。而当反应温度高于180 ℃时，微波处理所得的低聚木糖的得率下降较快，也是因为其加热特性所导致的。表1为所制备的低聚木糖的组成成分，包含聚合度从2到6的5种低聚木糖，其中，在反应温度较低时，高聚合度的低聚木糖较多，而随着反应温度的上升，木二糖的得率明显上升，而高聚合度的低聚木糖得率显著下降。Nakahara等[12]报道生物质自水解制备低聚木糖的降解机理：木聚糖中的侧链首先断裂，然后主链的β-木糖苷键发生断裂，生成长链的低聚木糖。而连接在糖链上的乙酰基则被解离，在水中形成乙酸以促进降解，将长链的低聚木糖进一步降解成短链的低聚木糖。在本研究中的最佳反应条件180 ℃时，微波处理的木二糖至木六糖的比例为40.3%、23.4%、17.1%、12.5%和6.7%。而与之相比，水热处理所得到的低聚木糖的组成比例有所不同，木四糖、木五糖、木六糖含量相对较高，这可能是由于加热方式不同导致的。微波处理可以从反应物内部加热，因而加热效率较高，而水热处理加热需要由外而内传导热量。因此，这可能导致其加热并不均匀，进一步导致低聚木糖在高温下的过度降解。因此，在水热反应为200 ℃时，所产生的低聚木糖得率很低，约为6.2%，而其中木二糖占69.4%。有研究[13-14]表明，聚合度较低的低聚木糖相较于聚合度高的低聚木糖，其益生元活性更好，因此，如何在获得高低聚木糖得率的同时降低其聚合度，有重要意义。从不同温度下微波处理和水热处理制备低聚木糖的对比不难看出，微波处理较水热处理有较大优势，主要表现在快速、高效、和高产率。

图1 微波辅助法和水热法制备低聚木糖的得率Fig.1 Yields of xylo-oligosaccharides obtained by microwave-assisted and hydrothermal treatment

图2 微波处理和水热处理的升温曲线Fig.2 Heating curves of microwave and hydrothermal treatment

组分Component微波处理/% Microwave-assisted treatment 160 ℃170 ℃180 ℃190 ℃200 ℃水热处理/% Hydrothermal treatment160 ℃170 ℃180 ℃190 ℃200 ℃木二糖 Xylobiose12.221.740.354.161.810.512.632.445.269.4木三糖 Xylotriose14.827.323.420.416.911.417.418.524.614.3木四糖 Xylotetrose13.425.117.113.28.423.127.323.811.06.1木五糖 Xylopentose31.913.512.57.79.121.822.712.87.52.6木六糖 Xyloshexos27.712.46.74.63.833.220.912.511.77.6

2.2 液体中的单糖

除了低聚木糖，微波处理和水热处理所得液体中还含有多种单糖，包括木糖、阿拉伯糖和半乳糖(图3)，其中阿拉伯糖和半乳糖为其在反应液体中的质量浓度，而木糖则为其相对于原料中半纤维素的得率。阿拉伯糖是植物半纤维素中广泛存在的一种五碳糖，一般以支链连接在半纤维素木聚糖主链的C-2和C-3位。在水解反应发生时，半纤维素的支链首先断裂，因此，阿拉伯糖支链首先被降解并溶解在反应液中。从图3-a中可发现阿拉伯糖在反应温度较低时有较高质量浓度，2种处理所得的最高质量浓度均出现在反应温度为170 ℃时，而此时水热处理液体中阿拉伯糖的质量浓度较高。另一方面，当反应温度为160 ℃，相对于低聚木糖的低得率，阿拉伯糖具有较高质量浓度，也说明它在水解反应中首先被降解。在温度为160 ℃时微波处理中所获得的阿拉伯糖质量浓度较高，说明微波加热的效率较高，而随着温度的增加，当温度超过170 ℃时微波反应所得的阿拉伯糖质量浓度迅速下降，也证明其加热效率更好。相对而言，在较低温度时水热反应所得的阿拉伯糖质量浓度较低，而随着温度的不断上升其质量浓度下降较慢，表明微波处理较水热处理在加热效率上具有优势。半乳糖是竹材半纤维素中所含的另一种支链，其水解后的质量浓度如图3-b所示。其中，微波处理和水热处理都在190 ℃得到最高半乳糖质量浓度，而且水热处理液体的半乳糖质量浓度仅在200 ℃时比微波处理液体中的半乳糖质量浓度高，这也是由微波处理的加热特性导致的。而另一方面，半乳糖质量浓度在低温时较低而随着温度升高其浓度增大，表明相对于阿拉伯糖，在水解过程中半乳糖更难被降解，半乳糖与木糖主链的连接键更强。

木糖是生物质自水解反应中得到的最主要的一种单糖，它是由于半纤维素的木糖主链发生降解生成低聚木糖，而后低聚木糖中的糖苷键进一步发生断裂所得。因此其得率随着反应温度的上升而明显增加。由图3-c可见，水热处理所得的低聚木糖从160 ℃时的2.7%上升到190 ℃时的17.3%，而当温度上升至200 ℃时得率略微下降，为16.2%。而微波处理所得的木糖较少，在190 ℃时木糖得率为13.2%。水热处理的木糖得率比微波处理高是因为水热处理加热需要由外而内，有热传导过程，因此加热不均匀，导致一部分低聚木糖过度水解。

a.阿拉伯糖 Arabinose；b.半乳糖 Galactose；c.木糖 Xylose

2.3 反应副产物

除低聚木糖和单糖，生物质的水解反应还产生一定量的反应副产物，主要包括甲酸、乙酸、糠醛和5-羟甲基糠醛，它们在产物液体中的质量浓度如图4所示。乙酸是微波处理和水热处理中所获得的最主要的一种反应副产物，它主要来源于反应过程中半纤维素中的乙酰基。在反应过程中，一部分乙酰基与木糖主链的连接键发生断裂，在溶液中形成乙酸，乙酸又进一步在溶液中生成水合氢离子，促进半纤维素的降解。因此，原料中的乙酰基是自水解反应能够发生的重要因素，而采用碱法提取的半纤维素，因为在提取过程中乙酰基与木聚糖主链的酯键均被断开，因此无法进行自水解反应以制备低聚木糖。本试验的溶液中乙酸质量浓度随着反应温度的上升而明显提高，在200 ℃微波处理和水热处理可以得到最高质量浓度的乙酸，分别为2.66 g/L和3.05 g/L (图3-a)。同时，在所有的反应温度下，水热处理液体中的乙酸质量浓度均比微波处理高，表明水热处理可以降解更多的乙酰基。而关于低聚木糖在益生元作用的研究表明，乙酰化的低聚木糖较未含任何取代基的低聚木糖其益生元活性更好，因此，如何在获得高低聚木糖产率的同时尽可能保留其乙酰基，有利于低聚木糖在食品和保健品领域的应用[1,15-16]。与水热处理比较，微波处理产生的乙酸少，表明有更多乙酰基保留在低聚木糖上，因此其相对于水热处理有一定优势。甲酸是反应后液体中的另一种有机酸，主要来源于糖的降解产物如糠醛、5-羟甲基糠醛的进一步裂解，因此在反应液体中含量较少，其质量浓度也随着反应温度的升高而有所提高，其中微波处理和水热处理均在200 ℃时获得最高的甲酸质量浓度，分别为0.31 g/L和0.37 g/L。而水热处理质量浓度更高，也是因为其加热不均匀所导致的。

糠醛是生物质水解反应中最主要的降解产物之一，它主要来自戊糖的降解，因此反应液体中糠醛的质量浓度随温度的升高而显著上升。图3-b中微波处理和水热处理所得液体中糠醛的质量浓度随着反应温度的上升从最初的0.11 g/L和0.1 g/L 升至200 ℃时的3.34 g/L和4.17 g/L，说明当反应温度过高时有大量的戊糖被降解，这对于低聚木糖的制备是不利的，因此要尽可能控制反应温度以降低糠醛的产生。在反应温度为180 ℃时，微波处理和水热处理液体中所含的糠醛质量浓度分别为0.45 g/L和0.62 g/L，相对于此时较高的低聚木糖得率(约30%)它们的质量浓度并不高，而微波处理所得的糠醛质量浓度更低，更有利于低聚木糖未来的应用。5-羟甲基糠醛是反应中己糖的降解产物，因为生物质的自水解反应在温度低于200 ℃时对于纤维素组分影响较小，只有少部分纤维素能被降解成葡萄糖。因此，反应液体中的5-羟甲基糠醛质量浓度比糠醛低很多，在制备低聚木糖的最佳温度时，反应液体中的5-羟甲基糠醛质量浓度仅为0.16 g/L(微波处理)和0.15 g/L(水热处理)。即使温度上升至200 ℃，相对于反应液体中5-羟甲基糠醛的质量浓度也并不高。

a.甲酸和乙酸 Formic acid and acetic acid；b.糠醛和羟甲基糠醛 Furfural and HMF

3 结 论

龙竹粉与去离子水混合分别通过微波辅助法和水热法进行处理以制备低聚木糖，在反应温度为180 ℃时可获得最大低聚木糖产率。在该反应温度下，微波处理可制备得到31.4%低聚木糖，比水热反应高，且此时液体中的单糖和副产物质量浓度也比水热反应更低。同时，微波处理的加热效率和所需的反应时间远低于水热处理，可以大大缩短制备低聚木糖所需时间，而且其加热更加均匀，有利于控制反应，以制备更多的目标产物。因此，采用微波辅助法降解生物质制备低聚木糖有良好的前景。