四川老卤泡菜基本理化指标及特征菌群分离鉴定

毛丙永，殷瑞敏，赵楠，崔树茂，赵建新，张灏，陈卫*

1(江南大学 食品学院，江苏 无锡，214122) 2(四川省农业科学院，四川 成都，610066)

四川泡菜风味形成主要由蔬菜、辅料以及微生物代谢所提供[1]。四川泡菜发酵过程中，乳酸菌利用原料中的糖，在密闭的泡菜坛中通过发酵产生丰富的乳酸以及其他风味物质，从而赋予四川泡菜独特的风味。发酵过程中乳酸积累，导致坛内pH值降低，从而抑制一些腐败菌的生长。泡菜中乳酸菌种类及含量直接影响到泡菜的质量[2]。目前，国内外学者从泡菜中分离到的乳酸菌主要有明串珠菌属、乳球菌属、乳杆菌属、肠球菌属、片球菌属、链球菌属和魏斯氏菌属等[3-4]。

目前，四川泡菜的制作方式主要分两大类：盐溶液泡渍发酵和老卤水泡制[3]。传统四川泡菜是盐水泡制新鲜蔬菜，经厌氧发酵而成，坛内盐水是长期反复使用，在泡菜坛内形成乳酸菌为主体的复合菌群，俗称“老卤水”[5]，优良的泡菜卤水重复使用[6]，其中的微生物处于活跃发酵状态。老卤水制作的泡菜，口感风味较佳，但由于老卤水需要长时间循环发酵获得[7]，且不同的老卤制作的泡菜难以标准化，因此该传统工艺很难应用于工业化产业。本文以四川老卤水泡菜为研究对象，研究其理化特征和风味物质，并分离其特征乳酸菌菌群，为实现优良菌株的有效利用奠定良好基础。

1 材料与方法

1.1 材料

老卤泡菜：共8份，采集于四川省某泡菜厂，均为发酵辣椒，采自8个不同的发酵大坛(1 000 kg)，编号为DT100、DT268、DT274、DT566、DT661、ZTC、XTC、TTC。

1.2 试剂

TaqDNA聚合酶mix，购于上海科晴生物科技有限公司；引物合成由生工生物工程(上海)有限公司完成；吡啶、核糖醇、甲氧胺盐酸盐、N-甲基-N-(三甲基硅烷基)-三氟乙酰胺，均购于美国Sigma公司；硝酸银、铬酸钾、硫酸、蒽酮、盐酸等均为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司；平板计数琼脂(PCA)、生化试剂BR(沃凯)，购于国药集团化学试剂有限公司。

1.3 培养基

MRS培养基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母膏5 g/L，柠檬酸氢二铵2 g/L，乙酸钠5 g/L，K2HPO42 g/L，MgSO40.58 g/L，硫酸锰0.25 g/L，吐温80 1mL/L，pH 6.2～6.4。

1.4 仪器与设备

SW-CJ-2FD型超净工作台,苏州尚田洁净技术有限公司；MLS-3750型灭菌锅,日本三洋公司；GRP-9080型隔水式恒温培养箱,上海森信实验仪器有限公司；T100型PCR仪,美国BioRad公司；全自动凯氏定氮仪，济南海能仪器股份有限公司；löser-om806m型冰点渗透压测定仪，德国löser公司；Allegra 6R冷冻离心机,德国贝克曼公司；气质联用仪Thermo Trace 1310气相色谱,美国Thermo公司；Thermo TSQ 8000 Evo质谱,美国Thermo公司；冷冻高速离心机,德国Eppendorf公司；pH计,瑞士Mettler Toledo公司；冷冻浓缩离心干燥机,美国Thermo公司。

1.5 试验方法

1.5.1 四川泡菜理化特征测定

pH值测定：取25 g泡菜样品，匀浆后采用8 000g离心5 min，采用pH计测定上清的pH值。

总酸含量测定：参考国标GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》。

总糖含量测定：称取5 g泡菜样品匀浆后加入25 mL蒸馏水煮沸30 min，冷却后过滤并定容至50 mL，取上清1 mL采用硫酸蒽酮法测定总糖含量。

总氮含量测定：称取5 g泡菜样品匀浆后加入25 mL蒸馏水煮沸30 min，冷却后过滤并定容至50 mL，取上清5 mL利用凯氏定氮法测定总氮含量。

NaCl含量测定：取5 g泡菜样品匀浆后定容至10 mL，取1 mL定容后的溶液进行盐含量测定，具体方法参照彭易涛[8]。

渗透压测定：取5 g泡菜样品于10 000×g离心10 min，取上清100 μL用超纯水稀释5倍后，取100 μL上清用渗透压测定仪测定。

1.5.2 挥发性物质测定

取5 g样品装入15 mL气相瓶，同时加入内标1 μL庚酸甲酯(20 mg/mL)。采用固相微萃取方法对泡菜进行挥发性成分的提取。样品于自动萃取台上50 ℃预平衡30 min，然后将萃取头DVB/CAR/PDMS插入萃取瓶中50 ℃萃取30 min。在无分流模式下240 ℃解吸2 min。

挥发性物质测定(GC-MS)：(1)气相色谱条件：RTX-WAX毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；载气：氦气；载气线速度：35.0 cm/s；分流进样：1∶10；柱初温40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升温至130 ℃并保持5 min，以25 ℃/min升温至155 ℃，以5 ℃/min升至220 ℃并保持5 min；进样口温度：240 ℃。(2)质谱条件：传输线温度220 ℃；离子源温度300 ℃；四极杆温度150 ℃；电子能量70 eV；质量扫描范围m/z15～500。由GC-MS得到的谱图，采用NIST 2001标准谱库检索及标准品比对进行物质定性。

1.5.3 非挥发性物质测定

非挥发性物质衍生化：称取5 g泡菜样品加入10 mL蒸馏水匀浆、过滤后，取汁液1 mL，采用10 000×g离心10 min后取上清液待用。取汁液1 mL常温下10 000×g离心5 min，取50 μL上清液并加入15 μL 0.2 mg/mL核糖醇溶液作为内标物质。室温冷冻浓缩离心干燥约2 h，待样品水分挥发后进行衍生化处理。加入30 μL 20 mg/mL甲氧基胺盐酸盐溶液37 ℃保温90 min，然后加入90 μLN-甲基-N-(三甲基硅基)-三氟乙酞胺(CMSTFA)400 ℃保温30 min，10 000×g离心5 min后待测。

非挥发性物质测定：(1)气相色谱条件：RTX-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；载气：氦气；载气线速度：35.0 cm/s；分流比：1∶10；柱初温70 ℃，以5 ℃/min升至230 ℃，以90 ℃/min升至320 ℃；进样口温度240 ℃。(2)质谱条件：传输线温度280 ℃；离子源温度300 ℃；四极杆温度150 ℃；电子能量70 eV；质量扫描范围m/z33～600。由GC-MS得到的谱图，采用NIST 2001标准谱库检索及标准品比对进行物质定性。

1.5.4 泡菜样品菌落计数

采用MRS和PCA两种培养基，对泡菜样品分别进行乳酸菌计数和菌落总数计数，计数方法按照《GB4789.35—2016食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》和《GB4789.2—2016食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》进行。

1.5.5 泡菜样品中乳酸菌的分离、菌落形态观察及菌株16S rRNA鉴定

取25 g泡菜样品，置于装有225 mL无菌生理盐水的无菌均质袋内，于无菌均质器中拍打3 min，得10-1样品匀液。然后，进行10倍系列梯度稀释，得10-2、10-3、10-4的样品匀液。取0.1 mL稀释度为10-1、10-2、10-3和10-4的样品涂布在MRS培养基平板上，置于37 ℃培养箱中培养48 h。

将培养基上形态不同的单菌落分别编号，观察其菌落形态特征并做记录与拍照。选取不同形态特征的菌株进行划线分离纯化，然后进行PCR扩增，其中上游引物27F：5′-AGAGTTTGATC-CTGGCCTCA-3′，下游引物1492R：5′-GGTTACCTTGTTACG ACTT-3′，扩增片段为1500 bp左右，反应体系(50 μL)：模板，1 μL；上游引物27F(20 μmol/L)，0.5 μL；下游引物1492R(20 μmol/L)0.5 μL；TaqDNA聚合酶mix，25 μL；双蒸水，23 μL。PCR扩增条件为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸5 min。PCR产物由生工生物工程(上海)有限公司完成测序；序列完成拼接并在NCBI数据库中进行BLAST比对，确定待测细菌的种属。

1.6 数据处理

实验数据采用SPSS 19.0分析处理，以平均值±标准差表示，采用ANOVA进行显著性分析，显著水平p<0.05，用不同字母表示；采用Origin 9.0软件处理作图，所有实验重复测定3次。

2 结果与分析

2.1 老卤泡菜pH值、总酸含量

乳酸菌可以利用蔬菜原料中的糖类作为碳源，经过发酵生成乳酸、乙酸等有机酸，降低体系pH值，从而抑制腐败菌和致病菌的生长，同时也可以改善泡菜的风味和口感[9]。泡菜的发酵阶段可根据pH值来划分，在各发酵阶段泡菜微生物组成和多样性会随着pH值的改变而变化[10]。

由表1可知，8份老卤泡菜样品的pH值均在4.0以下，且样品间差异不显著，平均pH值为3.59±0.22，与赵楠研究结果一致[5]。由总酸含量测定结果可以看出(表1)，样品DT100的总酸含量达到17.05 mg/g，显著高于其他7份样品(p<0.05)；这7份泡菜样品的总酸含量在10.78～13.01 mg/g，且差异不显著(p>0.05)。根据泡菜标准《SB/T 10756—2012泡菜》规定，泡菜总酸含量(以乳酸计)≤15 mg/g。样品DT100的总酸含量已经超标，而其他7份样品的总酸含量也较高，这可能是由老卤水多次循环使用造成的。

表1 老卤泡菜的pH值和总酸含量Table 1 The pH and total acid content in old brined Paocai

注：不同字母代表同一指标不同样品之间存在显著性差异(p<0.05)。

2.2 老卤泡菜总糖含量、总氮含量、NaCl含量和渗透压

传统四川泡菜在制作过程中常加入白砂糖来调节泡菜的口感，加入的白砂糖也会被乳酸菌利用，促进其迅速生长。泡菜制作过程中，蔬菜中的一些碳水化合物也会溶出，被微生物利用。苏扬等对泡菜的风味化学及呈味机理进行了探讨，经过微生物发酵后，蔬菜组织内的糖含量降低，而总酸含量增加[11]。如表2所示，8份泡菜样品的平均总糖含量为31.17 mg/g，其中DT100、DT274、DT566和DT661 4份样品中总糖含量较低，均在25 mg/g左右，ZTC样品中总糖含量最高，达到47.08 mg/g。

表2 老卤泡菜的总糖含量、总氮含量和NaCl含量Table 2 The total sugar content, total nitrogen content and total sodium chloride in old brined Paocai

注：不同字母代表同一指标不同样品之间存在显著性差异(p<0.05)。

蔬菜中含有糖类、肽、氨基酸、维生素等营养物质，这些营养物质可以通过渗透作用进入泡菜卤[12]，并被微生物利用，所以泡菜发酵过程中总氨基氮含量降低。如表2所示，8份泡菜样品的总氮含量均比较低，平均含量为0.17 g/100 g，其中，DT100总氮含量最低，为0.04 g/100g，DT274总氮含量最高，为0.26 g/100 g。赵楠测定了50份四川泡菜样品，其总氮含量平均值为0.16 g/100 g[5]，与本研究结果一致。盐水泡渍处理不仅直接影响泡菜的咸味，还能影响泡菜的微生物群落结构，从而进一步影响泡菜的质量和风味[13]。传统的泡菜盐度在2%～8%，赵楠研究了50份四川泡菜样品，其盐度平均值为7.02 g/100 g[5]。本研究检测的8份泡菜样品，盐度平均值为4.46 g/100 g，其中DT100、DT268、DT274、DT566和DT661样品的盐度较高，在5.35～6.43 g/100 g，而ZTC、XTC和TTC 3个样品的盐度较低，在1.17～2.90 g/100 g。

食盐、可溶性糖、有机酸以及其他可溶性物质，共同使泡菜具有一定的渗透压，高的渗透压会抑制腐败菌的生长，有利于泡菜的保藏。由表2可知，不同泡菜样品的渗透压差异显著，渗透压与泡菜的NaCl含量具有正相关性，NaCl含量高，则具有较高的渗透压。由表2可知，DT661的渗透压最高，为2 238 mOsm/kg，ZTC的渗透压最低，为434 mOsm/kg。

2.3 老卤泡菜特征性风味物质

特征风味物质包括挥发性物质和非挥发性物质。挥发性物质通常代表的是香味物质，是感官评定中香味指标的量化；非挥发性物质通常代表的是滋味物质，是感官评定中口感指标的量化。为了明确老卤泡菜中的风味物质的组成，对采集样品的挥发性物质和非挥发性物质进行检测。

2.3.1 老卤泡菜挥发性物质测定

经过GC-MS分析，8个泡菜样品中共检出54种挥发性化合物，其中包括烷烃21种、酯类13种、醇类7种、酚类2种、呋喃2种、醚类2种、醛类化合物1种、吡喃类化合物1种、硫化物1种、脲类1种、酸类1种、萜类1种和酮类1种。老卤泡菜的主要挥发性物质是烷烃、酯类等具有水果香味的物质，如图1所示。

1-甲基环戊烷；2-3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3醇丙酸酯；3-柠檬烯；4-乙酸乙酯；5-6,6-二甲基双环[3.1.1]庚烷；6-环己烷；7-1,3-双(1,1-亚甲基乙基)-苯；8-1-甲氧基-4-丙烯基氧-苯；9-庚酸乙酯；10-2-甲基-1-丁醇图1 老卤泡菜中的主要挥发性物质Fig.1 The major volatile compounds in old brined Paocai

主要的挥发性风味物质有10种，包括甲基环戊烷、3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3醇丙酸酯、柠檬烯、乙酸乙酯、6,6-二甲基双环[3.1.1]庚烷、环己烷、1,3-双(1,1-亚甲基乙基)-苯、1-甲氧基-4-丙烯基氧-苯、庚酸乙酯和2-甲基-1-丁醇。图1反映了每种风味物质的相对含量在8个样品中的离散程度，可以看出不同样品中风味物质的含量差异较大。陈功等[14]研究发现，四川泡菜的主体风味物质为二甲基硫化物、烯类和醛类，酯类含量较少，与本研究结果差异较大。周相玲等[15]发现自然发酵大白菜中的主要风味物质为二甲基二硫、二烯丙基硫醚和3-甲硫基丙烯。而这些风味物质的差异，是由发酵原料、乳酸菌发酵和酵母菌发酵等共同造成的。

2.3.2 老卤泡菜非挥发性物质测定

经过GC-MS分析，8个泡菜样品中共检出70种非挥发性化合物，其中包括有机酸类化合物18种、氨基酸类化合物15种、醇类化合物10种、糖类化合物8种、胺类化合物5种、烷烃类化合物6种并且检出少量种类的硫化物、酚、脲、醛、酯等物质。除乳酸外，相对含量在1%以上的物质共有18种(图2)，包括丙二醇、甘油、琥珀酸、草酸、甘露醇、磷酸、1-去甲基(2β, 3β)-蜡梅碱、葡萄糖、甘氨酸、3-氧杂-4-羟基-4-烯-2-辛亚胺、软脂酸、赤藓糖醇、γ-氨基丁酸、亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、丙二酸和果糖。其中，丙二醇的含量最高，在17.30%。周相玲等[15]在自然发酵的泡菜中检测到了酒石酸、乳酸、乙酸和琥珀酸等多种有机酸，陈卓等[16]在自然发酵泡菜中检测到了草酸、苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸6种有机酸。

1-丙二醇；2-甘油；3-琥珀酸； 4-草酸；5-甘露醇；6-磷酸；7-1-去甲基(2β, 3β)-蜡梅碱；8-葡萄糖；9-甘氨酸；10-3-氧杂-4-羟基-4-烯-2-辛亚胺；11-软脂酸；12-赤藓糖醇；13-γ-氨基丁酸；14-亮氨酸；15-缬氨酸；16-异亮氨酸；17-丙二酸；18-果糖图2 老卤泡菜中主要的非挥发性物质Fig.2 The major non-volatile compounds in old brined Paocai

值得一提的是，四川老卤泡菜中甘露醇和γ-氨基丁酸的含量较高。甘露醇由微生物代谢果糖产生，具有一定甜味并带有清爽感[17]。γ-氨基丁酸是一种动物、人体内具有生理调节功能的物质[18]，老卤水循环使用不仅积累了风味物质，也积累了一些活性物质，从而提高了泡菜的营养价值。

2.4 老卤泡菜特征乳酸菌的分离

2.4.1 老卤泡菜微生物数量

由表3可知，不同泡菜样品中乳酸菌数差异较大，在1.0×102～2.8×105CFU/g。通常来讲，同一样品的细菌菌落总数应该不小于乳酸菌总数，比较MRS和PCA两种培养基的菌落计数结果发现DT100、DT268、DT566、DT661、XTC和TTC样品中乳酸菌总数与细菌总数接近，表明泡菜中的细菌主要为乳酸菌。DT274和ZTC样品中细菌总数高于乳酸菌总数，表明2份泡菜中除了乳酸菌以外，还有其他微生物增殖。

表3 老卤泡菜的菌落计数结果Table 3 Colony counting results of old brined Paocai

注：不同字母代表同一样品MRS和PCA 2种培养基中计数结果的显著性差异。

2.4.2 老卤泡菜特征乳酸菌的分离与鉴定

根据泡菜的菌落计数结果，选用MRS培养基来分离乳酸菌。根据培养基中的菌落形态，从大小、表面观、边缘观、侧面观4个方面对菌落进行观察，最终挑选出36株菌进行16S rRNA鉴定，菌株编号及鉴定结果见表4。

表4 菌株序列比对结果Table 4 Sequence results of strains

续表4

3 结论

四川泡菜制作依赖老卤泡制，该文对8份老卤泡菜样品的理化指标进行了测定，发现老卤泡菜的pH值平均为3.59±0.22，总酸含量平均为(12.47±1.97) mg/g，总糖含量平均为(31.17±9.76) mg/g，NaCl含量平均为(4.46±2.17) g/100 g，总氮含量平均为(0.17±0.07) g/100 g，渗透压在434～2 238 mOsm/kg。

经过GC-MS分析，老卤泡菜中主要的挥发性风味物质是烷烃和酯类，包括甲基环戊烷、3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3醇丙酸酯、柠檬烯、乙酸乙酯等；主要的非挥发性风味物质包括乳酸、丙二醇、甘油、琥珀酸、草酸、甘露醇、γ-氨基丁酸、丙二酸和果糖等，其中甘露醇和γ-氨基丁酸是主要的活性物质。

从8份老卤泡菜样品成功分离到植物乳杆菌、布氏乳杆菌和耐乙醇片球菌3种乳酸菌，是老卤泡菜的优势和特征菌群，在泡菜发酵过程具有重要的作用。