钴60辐照灭菌参景片的适用性研究

后 宗，贡济宇

（长春中医药大学，长春 130117）

参景片为中药复方制剂，其含有人参、红景天、蜂王浆冻干粉等多种原料，对人体具有缓解疲劳的作用[1-6]。其中10-羟基-α-癸烯酸是蜂王浆冻干粉的主要有效成分，也是本品的质量控制指标之一。课题组在制剂的工艺研究过程中，采用钴60辐照方式对其进行灭菌。此灭菌法作为辐射灭菌中的一种，是近几十年来较为新型的技术，具有灭菌彻底、常温操作、无二次污染、节约能源等优点，广泛应用于食品、器械及医药领域[7-8]，但同时也可能引起制剂中的主要化学成分发生变化。现为研究钴60灭菌对本制剂的适用性，课题组在现有的基础上，通过HPLC法对制剂中有效成分10-HAD的含量[9-11]及方法系统适应性进行考察，分析10-HAD钴60辐照前后含量的变化情况，结合灭菌效果对钴60辐照的适用性作以评价。

1 材料

1.1 仪器 安捷伦1260高效液相色谱仪：紫外检测器（美国安捷伦科技有限公司）；ME204型万分之一天平（瑞士梅特勒托利多公司）；MS205W型十万分之一天平（瑞士梅特勒托利多公司）；KH-500B型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；ZP-7旋转式压片机（上海天驹制药机械有限公司）。

1.2 试药试剂 10-羟基-α-癸烯酸标准品（中国食品药品检定研究院，批号：110812-201507，含量为99.2%）；甲醇（色谱纯：CHROMADEX；分析纯：天津市福晨化学试剂厂）；磷酸（分析纯：天津市福晨化学试剂厂）；娃哈哈纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

2 方法与结果

2.1 辐照处理 钴源装载量6.6×105，辐照剂量9 kGy，辐照时间为32 h。

2.2 色谱条件 C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.4%磷酸溶液（50:50）；流速1 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：210 nm。

2.3 溶液制备

2.3.1 标准品溶液制备 取10-HAD标准品约10 mg，精密称定，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg的标准品储备液，分别精密量取标准品储备液0.2、0.4、0.6、0.8、1.2、2.4 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成浓度为4、8、12、16、24、48 μg/mL的标准品系列溶液。

2.3.2 供试品溶液制备 取本品20片，研细，取样品约1 g，精密称定，置25 mL量瓶中，加甲醇适量，超声提取15 min，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密吸取续滤液5 mL，置50 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3.3 阴性对照溶液制备 取去除蜂王浆冻干粉的配方，按制剂的制备工艺，依法制备蜂王冻干粉阴性样品。

2.4 辐照前后样品性状比较 按2.1项下辐照处理方法进行灭菌，取样对比样品辐照前后性的变化，结果表明，样品钴60灭菌前后性状无明显改变。

2.5 辐照灭菌效果 按2.1项下辐照处理方法进行灭菌，取样对比样品辐照前后微生物指标变化。结果辐照前霉菌数严重超标，菌落总数偏高，其他指标在合格范围内；辐照后所测指标均合格。表明样品钴60灭菌效果理想。见表1。

表1 辐照前后微生物指标变化

2.6 方法学考察

2.6.1 检测波长和专属性的考察

2.6.1.1 波长选择 按2.3项下各法制备10-HAD标准品溶液、供试品溶液及蜂王浆冻干粉阴性供试品溶液。取上述溶液及空白试剂，采用紫外-可见分光光度法，在190～800 nm波长下进行扫描，结果得10-HAD在210 nm处有最大吸收。

2.6.1.2 专属性考察 将2.6.1.1项下标准品溶液、供试品溶液、蜂王浆冻干粉阴性供试品溶液分别注入高效液相色谱仪中，按2.2项下色谱条件进行分析，结果表明蜂王浆冻干粉阴性溶液对供试品溶液中10-HAD的含量测定无干扰。

2.6.2 线性关系考察 按2.3.1项下方法制备标准品溶液，按“2.2”项下色谱条件进行分析，以10-HAD峰面积积分值为纵坐标，标准品进样浓度（μg/mL）为横坐标绘制标准曲线，得线性回归方程为：Y =40.894 X-23.935，r = 0.999 9。表明10-HAD的测定量在0.04～0.52 μg范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.6.3 精密度考察 按2.3项下方法制备标准品溶液（24 μg/mL）及供试品溶液，按2.2项下色谱条件连续测定6次，记录峰面积积分值，得标准品溶液及供试品溶液中10-HAD峰面积积分值的RSD分别为0.03%、0.04%，结果表明仪器的精密度良好。

2.6.4 重复性试验 取同一样品（批号20170501）6份各1 g，精密称定，按2.3.2项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进行分析，得10-HAD含量分别为 0.96、0.97、0.97、0.96、0.95、0.96 g/100 g，平均含量为0.96 g/100 g ，RSD为1.4%，小于3%，符合要求，表明该方法对本品中10-HAD测定结果的重复性良好。

2.6.5 回收率考察 取已知含量的样品（批号：20170501；含量为0.96 g/100 g）9份各0.5 g ，精密称定，将9份样品分为3组， 每组分别加入按2.3.1项下制备的标准品溶液，使加入量与所取供试品中10-HAD 的量之比约为0.5:1、1:1、1:1.5，按2.3.2项下方法制备供试品溶液，按2.2项下色谱条件进行分析，计算回收率，得10-HAD的平均回收率为97.5%，RSD为1.1%，小于3%，符合要求。见表2。

表2 回收率测定结果

2.6.6 稳定性考察 按2.3项下方法制备标准品溶液（24 μg/mL）及供试品溶液，按2.2项下色谱条件进行分析（室温条件下放置），分别于0、4、8、16、24、48 h依次进行测定，记录峰面积积分值，得标准品溶液及供试品溶液中10-HAD峰面积积分值的RSD分别为0.8%、0.7%，结果表明标准品溶液和供试品溶液在（0～48）h内稳定。

2.7 3 批样品测定 取3批（批号：20170501；20170502；20170503）钴60辐照前后的样品各1 g，精密称定，按2.3.2项下方法制备供试品溶液，按2.2项下色谱条件进行分析，结果3批样品中10-HAD含量在辐照前后基本一致，无明显变化。见表3。

3 小结

制剂中蜂王浆冻干粉是在低温真空条件下干燥而成的，避免了普通高温干燥造成的成分氧化、活性破坏等因素。课题组在研究过程中，对湿热灭菌法、干热灭菌法、钴60灭菌法、微波灭菌法等多个灭菌方法进行了分析筛选。其中湿热灭菌法及干热灭菌法都属于热力灭菌方法，湿热灭菌后对样品的性状产生了较大的影响。干热灭菌温度更高、时间更长，对成分含量的影响较大。微波辐射灭菌对物料内外同时加热，内部温度高、热量从内到外传导，加热时间短，虽可在较低温度下进行，但为保证10-HAD含量不受影响，最终选用常温灭菌下的钴60辐照灭菌。

辐照灭菌在食品和药品生产中已经成为不可或缺的工序。美国已将其写入药典。并在英国和欧盟等国家中广泛使用。安全性评价方面，中药辐照一般使用密封型钴60辐射装置，被照物在灭菌时不接触放射性元素，不沾染放射性物质[7,12]。1980年10月，“辐照食品联合专家委员会”归纳分析各国30多年安全性研究结果，确认“为储存目的，任何食物受到总平均剂量10 kGy以下的辐照（γ射线和10 MeV以下电子束），不再需要进行毒物学方面的检测，也没有特殊营养和微生物问题”[8,13]。因此，本品在9 kGy下钴60辐照后的安全性是有保障的。

含量测定方法的研究中，课题组对该方法的供试品制备过程，专属性，准确度，色谱条件，线性，精密度，溶液稳定性，耐用性等进行了系统的考察[14-16]。最后通过三批样品进行验证，结果表明该方法检测结果灵敏度高，稳定性好，可重复操作。

综上，研究通过微生物的灭菌效果和10-HAD含量变化对钴60辐照灭菌进行评价，并对10-HAD的含量测定方法做了系统适应性考察[17]，结果显示钴60辐照灭菌效果明显，能达到相关标准要求，且10-HAD的含量在钴60辐照前后基本一致，未发生显著性变化，为本制剂钴60辐照（辐照剂量9kGy）灭菌的适用性提供了依据。另外，课题组正在对制剂中其他指标成分钴60辐照前后的含量变化进行研究，以更好的评价本制剂钴60辐照灭菌的适用性。