肝脾同治方对哮喘小鼠Th17/Treg及Foxp3/ RORγt的影响

徐 丽，郭振武，贾连群，张 哲，王 英，张会永，宋 囡，岳志军，李 然，王 巍，赵 娜，秦文艳，甘 雨，李 爽

（1.辽宁省中医药研究院，沈阳 110034；2. 辽宁中医药大学附属第二医院,沈阳 110034；3.辽宁中医药大学，沈阳 110032；4. 辽宁中医药大学附属医院，沈阳 110034）

支气管哮喘是由多种炎性细胞、结构细胞等共同参与的一种慢性气道炎症性疾病，是儿科最常见的变态反应性疾病。随着气候环境等因素的改变，其发病率呈逐年上升的趋势，严重影响儿童的身心健康，给家庭和整个社会带来了极大的负担[1-2]。支气管哮喘有着强烈的遗传免疫因素特点，T 淋巴细胞亚群表达异常与哮喘气道炎症反应相关。以往文献及课题组研究显示Th1 /Th2失衡是哮喘的重要免疫机制之一[3-4]。但随着国内外研究的不断深入，Thl/Th2失衡不能完全解释哮喘的发生机制，Thl7细胞和调节性T细胞（Regulatory Tcell，Treg）及其代表性细胞因子IL-17、IL-10等与哮喘的发生机制存在着明显相关[5-6]。RORγt是Thl7细胞分化的关键转录因子，Foxp3是Treg细胞调节功能关系密切的特异性转录因子，为进一步在Th17/Treg及转录后基因调控方面进行研究，本实验旨在探讨肝脾同治方是否与Th17/Treg及调控转录因子Foxp3/RORγt相关，观察肝脾同治方对哮喘小鼠免疫失衡及可能的作用机制，以期证实肝脾同治方是否通过调节转录因子Foxp3/RORγt的失衡从而发挥临床疗效。

1 材料

1.1 动物 SPF级雌性 BALB/c 小鼠70只，体量（19.3±1.1）g，鼠龄6周 [ 辽宁长生生物技术有限公司，SCXK（辽）2015-0001]。随机分为 6组：空白组、模型组、肝脾同治方低剂量组（简称低剂量组）、肝脾同治方中剂量组（简称中剂量组）、肝脾同治方高剂量组（简称高剂量组）、地塞米松组，10 只 /组。

1.2 干预药物 肝脾同治方：陈皮、苦杏仁、麻黄、川贝等中药共 121.5 g 减压浓缩到 250 mL，终浓度为0.486 g/mL，参考文献加水煎煮 3 次合并后过滤[7]，低温放置备用。

1.3 试剂与仪器

1.3.1 主要试剂 氢氧化铝（国药集团化学试剂有限公司，批号：20141104）；卵清白蛋白（OVA，美国 Sigma）；高纯总RNA快速提取试剂盒（北京BioTeke公司）；Primer设计合成（生工生物工程（上海）有限公司）；SYBR Green （北京Solarbio公司）；Super M-mLV反转录酶（北京BioTeke公司）；2×Power Taq PCR MasterMix （北京BioTeke公司）RNase固相清除剂（北京天恩泽基因科技有限公司）；小鼠IL-10、IL-17A、 TGF-β1酶联免疫试剂盒（美国R&D 分装）；PBS 缓冲液（pH = 7.4）、生理盐水、蒸馏水实验室自制。

1.3.2 主要仪器 YLS-8A 多功能诱咳引喘仪（山东省科学院设备站）；JJ2000Y 型电子天平（常熟市双杰测试仪器厂）；微量移液器（芬兰BIOHIT公司，Proline）；荧光定量PCR仪（韩国BIONEER公司，Exicycler96）；超微量分光光度计（美国Thermo公司，NANO 2000）；旋涡震荡仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司，QL-901）。

2 方法

2.1 模型复制 建立 OVA 诱导的哮喘小鼠模型[8-9]。致敏阶段：第1 天和第14天共2次，模型组与各药物组每次每只小鼠给予2 mg 氢氧化铝的混悬液0.2 mL与10 μg OVA腹腔注射，空白组给予生理盐水腹腔注射；激发阶段：第 28 ～34 天，空白组小鼠予生理盐水雾化吸入激发，其他组予 1% OVA 溶液雾化吸入激发，1 次/d，每次 20 min。模型复制过程中，低剂量组小鼠死亡 1 只，经解剖为腹腔注射操作不当导致动脉出血所致。

2.2 干预方法 在小鼠造模激发阶段，每次激发前30 min 称重，进行灌胃干预，干预药物、剂量及时间见表 1。

表 1 干预药物、剂量及时间

空白组 10 19.4±1.3 蒸馏水 - 实验第28天 7模型组 10 19.3±1.3 蒸馏水 - 实验第28天 7低剂量组 9 19.3±1.6 肝脾同治方 3.95 实验第28天 7中剂量组 10 19.3±1.6 肝脾同治方 7.90 实验第28天 7高剂量组 10 19.3±1.6 肝脾同治方 15.80 实验第28天 7地塞米松组 10 19.4±1.1 地塞米松片 1.56×10-3 实验第28天 7

2.3 标本采集 行支气管插管，用冰的 PBS 灌洗 3 次， 1 mL/次，回收率80% 以上为合格，离心，收集肺泡灌洗液上清液，于-20℃冰箱内冷冻保存。取下肺组织，生理盐水冲洗后，迅速置于液氮中冷冻，后-80℃冻存，备用。

2.4 ELISA 法检测血清 IgE、支气管肺泡灌洗液 IL-10 、IL-17A、 TGF-β1水平变化。Real-time PCR检测Foxp3/ RORγt基因表达：1）组织总RNA提取：根据试剂盒，各组样本数值在1.8～2.2之间，OD260/OD280 nm下检测。2）将提取的总RNA逆转录进行cDNA合成：反应体系：RT Primer（1 μM）1.2 μL，dNTP（2.5 mM each）0.75 μL，5×Buffer 4 μL，RNasin 0.25 μL，加ddH2O至总反应体系为19.8 μL。3）实时荧光定量PCR反应：Foxp3/ RORγt基因及β-actin内参基因引物顺序如下表2，反应体系：cDNA模板1 μL，上下游引物（10 μM）各 0.5 μL，SYBR GREEN mastermix10 μL，用ddH2O补足至20 μL。反应条件：95 ℃ 10 min，1 个循环；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃30 s，40个循环， 25 ℃ 5 min，1个循环。本实验结果分析方法利用 2 - △△ CT 方法 。

表2 各基因引物序列

2.5 统计学分析 每组3个样本，每个样本设4个复孔平行实验，舍去误差较大数值，剩下数值的平均值作为最终保留数据，应用SPSS 17.0进行统计学分析。

3 实验结果

3.1 哮喘小鼠一般状态 空白组小鼠无明显症状，精神状态良好，呼吸平稳。模型组小鼠出现烦躁不安，易惊，毛色无光泽，头面部瘙痒，抓鼻抓腮，点头样喘息，呼吸急促困难，呼吸程度加深，有明显的腹式呼吸等哮喘发作症状[3]。

3.2 肺组织病理学观察 空白组肺泡形态结构完整，无炎症细胞浸润，管腔内无脱落的支气管上皮细胞及渗出物。模型组：肺泡壁变薄，排列紊乱，支气管及其伴行气管周围有大量炎症细胞浸润，支气管上皮黏膜脱落，黏膜褶皱增多，管腔内炎症分泌物增多，支气管管壁及气道平滑肌层明显增厚[3]。

3.3 各组 IL-17A、IL-10、TGF-β1的测定结果 见表3。

与空白组比较，模型组和各药物治疗组支气管肺泡灌洗液IL-17A、TGF-β1值显著升高（P＜0.05），IL-10值显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，各药物治疗组IL-17A、TGF-β1值显著降低（P＜0.05），IL-10值显著升高（P＜0.05）。

表3 哮喘小鼠IL-17A、IL-10、TGF-β1的测定结果（± s ） pg/mL

表3 哮喘小鼠IL-17A、IL-10、TGF-β1的测定结果（± s ） pg/mL

组 别 IL-17A IL-10 TGF-β1空白组 83.61±25.87 1656.52±95.78 70.98±23.88模型组 188.68±14.44△△735.09±61.72△△ 159.17±22.03△△

注：与空白组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型组比较，# P＜0.05，## P＜0.01

3.4 小鼠肺组织中Foxp3/ RORγt的表达情况 与空白组比较，模型组Foxp3表达显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，各剂量组、地塞米松组的Foxp3表达量显著升高（P＜0.05）；其中高剂量组Foxp3表达量最高。与空白组比较，模型组RORγt表达显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，各剂量组、地塞米松组的RORγt表达量显著降低（P＜0.05），地塞米松组RORγt表达量最低，高剂量组RORγt表达量低于其余剂量组，结果见表4。

表4 肺组织Foxp3/ RORγt mRNA表达的情况（± s ）

表4 肺组织Foxp3/ RORγt mRNA表达的情况（± s ）

组 别 n Foxp3 RORγt空白组 3 1.87±0.35 0.58±0.09模型组 3 0.92±0.15△△ 2.09±0.20△△低剂量组 3 1.08±0.02# 1.61±0.24##

注：与空白组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型组比较，# P＜0.05，## P＜0.01

4 讨论

小儿哮喘是儿科常见的呼吸系统疾病，以反复的咳喘、呼吸困难等为主要症状[10]。哮喘的发病机制复杂，至今尚无完整学说可以阐明[11]。临床上，在非急性发作期时，多数情况下患儿咳喘表现虽然不重，但是存在症状消失缓慢、病程较长或者反复出现咳喘等情况，给患儿的学习生活带来诸多不便[12]。目前西医治疗常用糖皮质激素、白三烯受体拮抗剂等抑制哮喘炎症，但远期疗效并不满意，并且安全性存在一定的问题[13-14]。中医治疗本病具有独特的优势，根据小儿“肝常有余”“脾常不足”的生理特点及五脏相关理论，肝脾同治方用于治疗小儿哮喘，具有一定的理论基础和临床意义。哮喘慢性气道炎症发病机制复杂，促炎的Thl7细胞和抑炎的Treg细胞相互对立，相互制约以维持动态平衡，一旦Thl7/Treg平衡失调，Thl7分化增多，出现相关炎性反应的病理形式，导致哮喘的发生。本实验结果发现模型组小鼠IL-17A值显著升高，IL-10值显著降低，在某种程度上证实了Th17/Treg免疫失衡是哮喘慢性气道炎症的重要环节之一，与文献报道[15-16]哮喘小鼠IL-17A细胞数量增多而IL-10细胞数量减少结果一致。

Foxp3是Treg细胞特异的关键转录因子， RORγt是Thl7细胞分化必不可少的转录因子， Foxp3和RORγt最终决定了Treg/Thl7分化方向。Foxp3是转录因子forkhead/ winged-hellx（叉头样/翼状螺旋）家族的成员[17]，Foxp3在调节性T细胞的发育和功能中起着决定性作用。RORγt是维甲酸相关核孤儿受体（retinoid-related orhan receptors，ROR）的家族成员之一，是Thl7分化的特异性关键转录因子，仅在淋巴细胞中表达，受STAT3的调控，RORγt的缺失会导致Thl7的分化缺失。

哮喘小鼠肺组织中RORγtmRNA高表达，提示小鼠在致敏原的刺激下，肺组织中单核巨噬细胞、上皮细胞等分泌大量的TGF-β，TGF-β是影响Thl7细胞分化过程中的关键的细胞因子，同时也是影响Treg分化的重要调节因子。在TGF-β等局部炎症的作用下，引起RORγt基因高表达，诱导初始T细胞向Thl7分化。IL-l7与上皮细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞等炎性细胞表面的IL-l7受体结合，进一步释放各种炎症因子、趋化因子，进一步促进炎症的发生。通过实验我们证实了哮喘小鼠慢性气道炎症与Foxp3/RORγt平衡一致的Treg/Thl7相关，哮喘小鼠Foxp3/RORγt转录因子的失衡表达，很可能导致Th0向Thl7优势分化，引起哮喘的免疫失衡状态。各剂量组均表现出Foxp3mRNA水平的升高和RORγtmRNA水平的降低，以高剂量组最为明显。提示肝脾同治方可能通过升高了血清中IL-10水平、降低血清中IL-17、TGF-β1水平，降低肺组织RORγtmRNA水平，升高肺组织Foxp3mRNA水平而起到良性调节Thl7/Treg平衡机制的效应，起到调节哮喘小鼠慢性气道炎症的作用。