原发性肺癌患者Notch1基因rs3124599位点单核苷酸多态性与肺癌易感性的相关性分析

于红，胡强，王利玲，苏晓勇，周建平

(1攀枝花学院临床医学院，四川攀枝花617000；2 攀枝花学院医学院)

随着多种环境致癌物接触率及吸烟率的增加，我国肺癌的发病率逐年上升，，患者5年生存率不足20%。提高早期诊断率和改善肺癌治疗方案是目前肺癌的研究热点，其中早期诊断依赖于危险因素的识别及高危人群保护[1]。吸烟是肺癌的环境危险因素，其一级预防以禁烟和控烟为主。但流行病调查发现，无吸烟史的人群中肺癌发病率仍属于较高范畴；其次，吸烟人群中个体肺癌发病情况及病情严重程度亦有较大差异，提示除环境因素外，个体遗传也可能是肺癌发病的危险因素[2]。梁平等[3]报道，家族史在肺癌发生、发展中起重要作用。基因多态性与药物耐药、环境反应及肿瘤发生具有紧密关系[4]。研究[5]发现，脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶1(APE1)、细胞色素P4501A1(CYP1A1)、醌氧化还原酶1(NQO1)、谷胱甘肽转硫酶M1(GSTM1)等基因的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms，SNP)与肺癌的易感性有关。Notch基因可编码一类高度保守的细胞表面受体，调节多种生物细胞的发育。Notch1信号通路可调控多能祖细胞的分化、凋亡、增殖及细胞边界形成。Cao等[6]研究认为Notch1基因突变在致癌过程起重要作用。 Notch1基因突变与主动脉瓣疾病、头颈部鳞状细胞癌及乳腺癌等疾病的发生发展有关。目前Notch1基因SNPs与肺癌患者易感性的关系相关报道罕见。2014年12月～2016年12月，我们分析了原发性肺癌患者Notch1基因rs3124599位点SNPs与肺癌易感性的相关性,旨在为临床早期诊断肺癌提供理论依据。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2014年12月～2016年12月间于我院确诊的原发性肺癌患者78例(观察组)，其中男53例，女25例，年龄43～72(58.41±13.06)岁；参考2004版“肺及胸膜肿瘤组织学分类”修订方案，均经支气管镜活检标准/手术切除标准病理学确诊为原发性肺癌；WHO肺肿瘤组织学分型为腺癌39例、鳞癌27例、小细胞癌4例、其他型8例 ；UICC第7版TMN分期为Ⅲ期47例、Ⅳ期31例。排除标准：①入院前接受过放化疗、抗癌药物等相关治疗的患者；②病情危重不能保持清醒意识患者；③自身免疫性疾病患者。选择我院非呼吸科患者及患者同一社区健康人群作双重对照，共纳入156例(对照组)，其中男106例、女50例，年龄(56.72±11.85)岁；既往均无肿瘤史或体征。两组纳入者间均无血缘关系，观察对象本人或其家属签署知情同意书，本实验符合医院伦理委员会要求并通过审批。

1.2 试剂及仪器 人全血DNA提取试剂盒由北京天根生化科技有限公司提供，PCR引物采用Primer Premier 5.0设计，在上海生工生物工程股份有限公司帮助下合成，TaKaRa Ex Taq DNA聚合酶、10×Ex Taq Buffer及dNTP均购于宝生物工程(大连)有限公司。QX200 PCR扩增仪及GelDocez全自动凝胶成像分析系统均购于美国Bio-Rad公司，EP管及各型号枪头盒购自美国AXYGEN公司，-80 ℃超低温冰箱来自日本三洋公司，低温超速离心机购于美国贝克曼公司，其他仪器包括德国centrifuge5810r台式低温离心机、101-4A电热鼓风干燥箱，日立U-3900紫外可见分光光度计。

1.3 Notch1基因rs3124599位点分析方法方法 抽取两组晨起肘部静脉血2 mL，静置30 min,采用酚-氯仿抽提法提取DNA。将300 μL血清样本、300 μL细胞裂解液、10 μL蛋白酶K依次加入1.5 mL离心管，轻摇振荡，56 ℃水浴5 h。加入等体积饱和酚，摇匀，12 000 rpm/min离心7 min，加入酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)的混合液，离心后吸取上清液，加入等体积氯仿和异戊醇(24:1)，再次离心，静置10 min分层后取上清。加乙酸钠及2.5倍体积的无水乙醇，出现沉淀后离心去上清，低温静置过夜。75%乙醇洗涤3次，真空干燥，加入适量PH=8的TE溶解沉淀。紫外分光光度计对研究对象基因组DNA的纯度和浓度进行检测，DNA的OD260/OD280在1.6～1.9之间时纯度符合要求。-20 ℃冰箱保存备用。采用PCR-PFLPS技术分析Notch1基因rs3124599位点分型，引物上游：5′-CACTCATCCACGTCGCTTC-3′；引物下游：5′-GCAAATGTGTGTTTGCTGCT-3′。PCR扩增条件：反应总体系为25 μL，其中含1×PCR buffer、25 μmol dNTP、1 μmol/L上下游引物、0.5 U Taq DNA聚合酶、100 ng 目的模版DNA，加双蒸水补充剩余体积。高速离心，震荡混匀。反应条件：95 ℃预变性10 min，92 ℃变性30 s，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸60 s,共47个循环，72 ℃延伸3 min。2%琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切产物(扩增长度为420 bp)，EB染色。所有样本检测结束后送北京六合华大基因科技有限公司进行单向分析测序。 PCR产物酶切后，产生3种基因型，分别为AA纯合子(未经切割420 bp)、AG杂合子(60 bp，260 bp，420 bp)、GG纯合子(260 bp、160 bp)。见图1。

图1 Notch1基因rs3124599位点(A/G)碱基序列图

1.4 环境因素与肺癌易感性相关性分析方法 记录并比较两组年龄、性别、BMI、家族史、肺部疾病史、吸烟状况、饮酒否、职业暴露史、油烟暴露史等基线资料。家族史为研究对象任何一个一级亲属(父母、同胞)患有肿瘤；油烟暴露为从事烹饪工作15年以上，烹饪过程中伴有烟雾刺激感；吸烟状况分为不吸烟(累计吸烟<100支)、吸烟(轻度≤29包/年，重度>29包/年)；职业暴露史则是指某些从事特定职业的劳动者在劳动过程中因受到致癌物刺激而发生癌性病变，多见于石棉、煤焦油、金属冶炼等职业人群；饮酒阳性判定为每周饮酒至少一次且连续半年以上者。肺部疾病史主要包括肺结核和哮喘患病史。资料记录采用问卷调查形式，由2名专业人员独立进行，数据核对一致后方可入库。采用条件Logistic回归分析法评价各因素与肺癌易感性的相关性，引入水平为0.05，剔除标准为0.01。采用交互作用系数(γ)评估环境因素与基因多态性的交互作用，γ= βeg/ βe(γ>1为正向交互作用， γ<1为负向交互作用， γ=1表示无交互作用)。

2 结果

观察组Notch1基因rs3124599位点基因型AA、AG、GG的分布频率分别为25.6%(20/78)、39.7%(31/78)、34.6%(27/78)，等位基因A、G的分布频率分别为45.5%(71/156)、54.5%(85/156)；对照组分别为37.2%(58/156)、44.9%(70/156)、17.9%(28/156)，等位基因A、G的分布频率分别为59.6%(186/312)、40.4%(126/312)；两组基因型分布及等位基因A、G的分布频率差异存在统计学意义(χ2=6.518，3.987；P均<0.05)。对照组符合Hardy-Weinberg遗传平衡，具有群体代表性。

观察组BMI(23.03±3.17)kg/m2,存在肿瘤家族史16例，吸烟状况为不吸烟22例、≤29包/年者20例、>29包/年36例，存在职业暴露史者5例，油烟暴露史者15例，饮酒史者23例，存在肺结核者8例，存在哮喘者17例。对照组 BMI(23.80±3.19)kg/m2,存在肿瘤家族史14例，吸烟状况为不吸烟91例、≤29包/年者38例、>29包年27例，存在职业暴露史者7例、油烟暴露史者34例、饮酒史者44例，存在肺结核者22例、哮喘者28例。观察组患者在年龄、性别、BMI、肺部疾病史、饮酒否、职业暴露史、油烟暴露史等方面与对照组人群无差异(P>0.05)，具有可比性。观察组吸烟例数、吸烟程度、存在肿瘤家族史者均高于对照组(χ2=23.890，5.647；P均<0.05)。

条件Logistic回归分析显示，与rs3124599位点AA型基因人群比较，rs3124599位点GG基因型的个体患肺癌的风险性增加(校正OR=1.596，95%CI：1.058～2.429)；且携带G等位基因的个体患肺癌的危险度是A基因的1.193倍(95%CI：1.132～2.501，P<0.05)。

矫正年龄、性别、饮酒、职业、肺部疾病等变量后，按是否携带G等位，将rs3124599位点基因型分为AA、AG/GG两大类。观察组存在肿瘤家族史者 Notch1基因rs3124599位点基因型AA、AG/GG分别为7、9例，对照组存在肿瘤家族史者 Notch1基因rs3124599位点基因型AA、AG/GG分别为10、4例；观察组吸烟者 Notch1基因rs3124599位点基因型AA、AG/GG分别为12、44例，对照组存在肿瘤家族史者 Notch1基因rs3124599位点基因型AA、AG/GG分别为15、50例。以基因以携带AA型且无吸烟/家族肿瘤史的个体为参照，结果显示rs3124599位点AG或GG基因型与吸烟(γ=2.296)、饮酒(γ=1.130)具有正向交互作用。rs3124599位点AG/GG基因型与肿瘤家族史同时存在时，患者发生肺癌的风险增加(OR=3.751，95%CI=1.665～18.034)。相对于rs3124599位点基因型为AA且不吸烟的个体，单独吸烟、吸烟且rs3124599位点基因型为AG/GG暴露者患肺癌的危险性分别升高4.495、12.134倍。

3 讨论

肺癌的发生是一个多因素、多基因参与的多阶段过程。目前，对其病因的探索主要集中在环境因素、遗传因素两方面。环境因素中，吸烟是公认的高危因素，烟草中的大量致癌物可损伤细胞得遗传物，激活癌基因，下调抑癌基因的表达，诱发肺等多个器官发生癌变[7]。王刚等[8]研究发现吸烟量、吸烟时间与罹患肺癌的危险比呈正相关，且存在剂量-效应关系。环境因素中环境暴露及油烟暴露也是肺癌发病的危险因素[9]。其他可能致病因素还包括肺部疾病史，其与肺癌关系的报道并不少见，目前较为认可的是哮喘、肺结核可能促进肺癌进展。哮喘患者肺部清除能力减弱，吸入的有毒颗粒物不能尽数排出，肺癌危险度因此增加，这在李留成等[10]的研究中得到证实。

肺结核与肺癌虽是病因不同、治疗不同的两类疾病，但二者理论上确有并存可能，结核杆菌感染导致机体免疫功能异常，癌变阻力减小，同时反复炎症刺激造成肺局部细胞增生活跃，后期可形成非典型增生。 肿瘤家族史是较早被关注的遗传因素，先证家系中一级亲属患病风险是其配偶的数倍，由此引发了国内外学者对遗传易感性的广泛关注。而后几十年，基因多态性参与肺癌形成过程的结论得以显示，以上种种提示基因突变和SNP在肿瘤的发生，癌症发展和肿瘤预后中起关键作用。SNP可以改变基因产物的序列，调节基因的表达，或影响基因的功能以改变表型。

Notch1基因位于9q34.3中，编码NOTCH蛋白家族成员。Notch1基因的表达失调与癌症的风险，发展和预后紧密相关，Notch1基因表达异常与疾病发展有关。50%以上的T细胞急性淋巴白血病患者存在Notch1基因突变[11]。本研究中，调整吸烟、职业暴露等环境因素及肿瘤家族史后，发现rs3124599位点GG基因型的肺癌风险高于携带AA基因型的个体，同时携带G等位基因的个体患肺癌的危险度是A基因的1.193倍。Notch1基因rs3124599位点同rs3124599，rs3124607一样位于Notch1基因内含子区域内，对蛋白序列的改变微乎其微，但其调节Notch1及其他基因转录的能力使其在调控疾病易感性及药物敏感性方面拥有较大优势[12]。rs3124599可能会影响转录因子结合，增加基因表达调控的复杂性，A突变为G时，整个Notch1基因表达亦会随之变化，且并非单一化增高或下降[13]。

Notch1成为致癌基因还是肿瘤抑制因子主要取决于肿瘤的类型和细胞环境，非小细胞肺癌中Notch1异常活化，促进肿瘤细胞增殖，与患者病情的进展和不良预后相关。小细胞肺癌患者Notch1的过表达可引起G1细胞周期阻滞并且可抑制上皮- 间质转化，具有抑制上皮间质转化、细胞运动及转移的潜能[14]。本文研究亦发现，AG基因对肺癌的影响并不显著，推测原因可能是因为多个基因参与其中，单个突变位点或杂合突变基因型对其危险性的改变并不明显，但是突变纯合子能进一步提高患病风险。

由于遗传易感性和环境因素在复杂疾病中相互影响和相互作用，故我们分析吸烟、饮酒家族史与Notch1基因rs3124599多态性的交互作用，结果显示，AG或CC基因型与吸烟、饮酒具有正向交互作用。AG/GG基因型与肿瘤家族史同时存在时，患者发生肺癌的风险增加，提示GG突变型可能比AA型更能影响Notch1表达，导致Notch1激活/抑制，进而诱发肺癌。在吸烟、肿瘤家族史等危险因素的共同作用下，GG型基因个体癌发病风险大大提升。提示临床可据此辅助删选高危人群，进行病因预防和早期诊断。

本研究因纳入排除标准和外在条件有限，样本量略有不足，仅选择了攀枝花地区的人群；其次，关于Notch1基因多态性的研究较为局限，未能分析该基因多个SNPs及现有基因多态性的交互作用，笔者将在日后的研究中纳入更多不同地域的人群，加大样本量，深入分析Notch1基因多态性突变的机制和意义，细分SNPs探究各因素与肺癌发生的关系。

综上所述，肺癌患者Notch1基因rs3124599位点G等位基因突变频率较高。Notch1基因rs3124599(A/G)的G等位基因可能是肺癌患病风险的一个危险因素，其与患者肿瘤家族史、吸烟史间存在交互作用。