缺氧新生鼠胼胝体神经元-胶质细胞抗原2 、胶质纤维酸性蛋白表达观察

王晓舟，王宇，张振中，姚瑞芹

(1徐州医科大学机能学实验中心，徐州 221004;2徐州医科大学神经生物学研究中心)

脑白质损伤(WMI)是早产儿特有的脑损伤形式之一，WMI的病理特点主要包括反应性星形胶质细胞和小胶质细胞活化、少突胶质前体细胞(OPCs)损伤导致的髓鞘形成障碍和轴突病变等，多数WMI患儿会表现出感觉、运动和认知功能等障碍[1, 2]。目前临床尚无WMI的有效根治措施。胎儿脑组织少突胶质细胞系以OPCs为主，人孕23～32周时胎儿脑组织OPCs对缺氧条件最敏感，缺氧可导致OPCs损伤，使少突胶质细胞分化成熟障碍，最终导致WMI[3]。OPCs标记物神经元-胶质细胞抗原2(NG2)，星形胶质细胞标记物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)可用于显示缺氧损伤后OPCs和星形胶质细胞的数目变化情况。目前国内外通常采用新生鼠缺氧缺血(hypoxia-ischemia，HI)的方法来制作WMI动物模型，从而进一步研究WMI的发病机制及相应治疗措施[4～7]。6%、8%氧气浓度均能成功建立缺血缺氧WMI模型，但两者造成的脑组织损伤程度及具体作用机制目前尚不清楚。2014年3月～2016年4月，我们观察了缺氧新生大鼠胼胝体NG2、GFAP的表达变化，旨在为WMI的发病机制研究提供相关理论支持。

1 材料与方法

1.1 动物及试剂 新生3 d Sprague-Dawley(SD)大鼠36只及其母鼠，SPF级，雌雄不限，由徐州医科大学实验动物中心提供，动物生产和使用许可证号码分别为SCXK(苏)2005-0005和SYXK(苏)2005-0018。兔抗神经元-胶质细胞抗原2(neuron-glial antigen 2，NG2)抗体购自 Millipore公司，鸡抗胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)抗体购自 Novus Biologicals公司，山羊抗兔IgG/FITC荧光二抗购自Santa Cruz公司，驴抗鸡IgG/TRITC荧光二抗购自Jackson ImmunoResearch公司。

1.2 动物分组及HI损伤模型制作方法 取 SD大鼠36只，随机分为对照组、低浓度组(6%氧)、高浓度组(8%氧)各12只。对照组新生鼠不做任何处理。低、高浓度组制作HI损伤模型：大鼠吸入乙醚吸入麻醉，仰卧位固定四肢、头部，消毒颈部皮肤，无菌条件下作颈部正中约0.5 cm切口；逐层分离皮下组织，分离右侧颈总动脉(氧损伤侧)后结扎，缝合皮肤；术后待大鼠麻醉清醒后放回母鼠笼中，恢复2 h；取两组新生鼠，置于ZKY-4F智能控氧仪缺氧仓(杭州艾普仪器设备有限公司)，缺氧仓置于37 ℃恒温水浴箱，低、高浓度组分别用6%、8%氧气浓度混合氮合气，2 L/min持续灌注2 h。造模成功后将两组新生鼠放回母鼠身边常规喂养。

1.3 脑组织切片制备及NG2、GFAP检测方法 采用免疫荧光染色法。分别于造模2、3、4周时各组取4只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉后，用温生理盐水及预冷的4%多聚甲醛行心脏灌流术进行脑组织固定，待大鼠四肢和尾部僵直、肝脏变白变硬后停止灌注。断头取脑，鼠脑冠状位分别切大鼠氧损伤侧及对照侧组织，置于4%多聚甲醛4 ℃后固定12 h。20%、30%梯度蔗糖脱水，OCT(日本樱花)包埋，连续切20 μm片，-80 ℃备用。选取切片用0.01 mol/L PBS冲洗3次，每次5 min。加入含有5% BSA、0.3% Triton X-100的PBS 37 ℃封闭40 min。分别滴加抗NG2(1∶1 000)和GFAP(1∶1 000)抗体， 4 ℃孵育过夜；PBS充分洗涤后加相应的二抗(1∶200)，室温孵育1.5 h，DAPI染核5 min。每只大鼠选取3张切片，每组共选取12张切片，荧光显微镜下观察拍照,使用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件计数200倍显微镜下胼胝体部位免疫荧光阳性细胞数。

1.4 各组大鼠存活情况观察 造模4周时观察各组大鼠存活情况(不包括手术过程中死亡新生鼠)。

2 结果

造模2、3、4周时各组氧损伤侧及氧损伤对照侧脑组织NG2阳性细胞数比较见表1、图1。

表1 造模2、3、4周时各组氧损伤侧及氧损伤对照侧脑组织NG2阳性细胞数比较(个

注：与氧损伤对照侧比较，*P<0.05；与低浓度组氧损伤侧比较，#P<0.05。

造模2、3、4周时各组氧损伤侧及氧损伤对照侧脑组织胼胝体GFAP阳性细胞数比较见表2、图2。

造模4周时，低浓度组、高浓度组、对照组大鼠分别存活9、10、12只。与低浓度组比较，对照组、高浓度组大鼠存活数目多。

图1 造模2、3、4周时各组氧损伤侧及氧损伤对照侧脑组织NG2表达

组别 GFAP阳性细胞数造模2周造模3周造模4周 低浓度组 氧损伤侧499.1±18.7256.0±19.5212.9±26.3 氧损伤对照侧792.7±14.4*500.7±20.7*405.3±25.2*高浓度组 氧损伤侧353.1±9.1217.1±19.4206.7±24.8 氧损伤对照侧597.9±13.6*#404.9±23.0*#375.2±23.7*

注：与氧损伤对照侧相比，*P<0.05；与低浓度组氧损伤侧相比，#P<0.05。

图2 造模2、3、4周时各组氧损伤侧及氧损伤对照侧脑组织GFAP表达

3 讨论

迄今为止，新生儿脑白质损伤疾病尚无有效的治疗方法，主要原因在于损伤的机制不清。因此，需要一个能够准确模拟该疾病发生发展过程的动物模型来阐明脑白质损伤的机制，进而为新生儿脑白质疾病治疗提供实验依据。研究[4, 7]表明，新生大鼠缺血缺氧诱导的脑白质损伤模型制作简单、方便，能较好模拟临床新生儿脑白质损伤，是研究和治疗脑白质损伤疾病的理想动物模型。6%氧损伤和8%氧损伤都能成功建立缺血缺氧脑白质损伤模型，但两者具体损伤区别和机制还不清楚，新生3 d的SD大鼠6%和8%氧损伤哪个更适合制作研究和治疗脑白质损伤疾病的大鼠动物模型，目前亦未见详细有报道。

新生儿缺氧缺血性脑白质损伤是造成慢性神经系统功能障碍的主要原因。OPCs作为未成熟的少突胶质细胞，可在体内增殖、迁移、分化、成熟，形成髓鞘发挥作用[8～10]，但也有研究[11]表明，OPCs极易受到HI损伤的影响，在缺血后的24和48 h，OPCs的数量有短暂性减少，其大小和形态转向更未成熟的形式，并且发现OPCs可能出现了迁移。另有研究[12]表明，HI损伤后14 d损伤半球有增殖细胞大量的存在，在损伤后21～35 d，胼胝体产生的少突胶质细胞数量是对照组4倍，而损伤后35 d，少突胶质细胞、星形胶质细胞等大量表达于损伤侧胼胝体区。这表明在HI损伤后初期OPCs受到急性损伤，之后HI损伤信号可能迫使SVZ区或胼胝体区的神经干细胞和少突胶质前体细胞的增殖，补充受损的OPCs，因此造成损伤侧NG2阳性细胞数急剧增加，所以HI损伤后2周时NG2(OPCs标记物)阳性细胞大量表达。6%氧损伤组较8%氧损伤组损伤严重，可能是由于受局部不利微环境的影响，受到损伤的OPCs相对较多，所以损伤后2周时OPCs的数目较8%少。而造模3周和4周时，8%氧损伤组损伤程度较低，相对于6%氧损伤组有更多OPCs分化成了少突胶质细胞，导致OPCs减少，故在OPCs数量上6%氧损伤组与8%氧损伤组相比，差异无统计学意义。结果提示，6%氧损伤组OPCs的减少可能是由于受到严重损失后微环境内平衡失调，导致OPCs向少突胶质细胞分化的效率降低，致使髓鞘发育受阻，而8%氧损伤组OPCs的减少是因为损伤较轻，更多的OPCs可以向少突胶质细胞分化，OPCs数量同样减少，所以结果显示6%氧损伤组损伤侧NG2的表达量仅在2周显著低于8%氧损伤组，而造模3周、4周时两组均无显著性差异。

星形胶质细胞是影响中枢神经系统病理损伤后髓鞘再生的一个重要因素，其主要作用于细胞外的基质，神经系统损伤后它们会被激活并形成胶质瘢痕，但过度的瘢痕组织形成对中枢神经系统神经修复和再生起到抑制作用[13～16]。本研究检测到星形胶质细胞标记物GFAP在HI损伤后2周时大量表达，并且这种现象持续到损伤后第3周和第4周。 6%氧损伤组损伤侧GFAP阳性细胞数在2周和3周时显著高于8%氧损伤组损伤侧，4周时两组无显著性差异。以上实验数据表明，HI损伤后2周至4周，大鼠损伤侧胼胝体星形胶质细胞增殖，2周增殖最显著，且6%氧损伤组较8%氧损伤组促星形胶质细胞增殖更加显著，激活星形胶质细胞可能会抑制OPCs向少突胶质细胞分化，以及阻碍髓鞘的形成。

本研究使用新生3 d SD大鼠建立缺血缺氧模型，对其右侧颈总动脉结扎，并分别给予6%氧和8%氧2 h造成缺氧损伤。实验亦观察了不同缺氧模拟WMI 4周后大鼠的存活率，8%氧损伤组存活率与对照组相比差异无统计学意义，但6%氧损伤组存活率显著低于对照组，提示过度缺氧可能会对造模动物造成更为严重的损伤，从而致死。新生3 d大鼠6%或8%氧损伤可诱使OPCs表达，但同时6%氧损伤较8%氧损伤会大量促进星形胶质细胞增殖，可能导致OPCs向少突胶质细胞分化的过度抑制，从而造成脑白质损伤加重，导致6%氧损伤组大鼠模型存活率明显减低，因此，我们认为8%氧损伤更适合建立SD大鼠HI模型。

综上所述，缺氧可导致新生大鼠胼胝体NG2 、GFAP表达升高。6%、8%氧浓度均可导致新生大鼠胼胝体NG2 、GFAP表达升高，且8%氧浓度作用更强。