附子理中丸灌胃后脾阳虚证大鼠海马组织β-EP、cAMP、PKA、神经元细胞μ受体表达观察

孙大宇，单德红，刘旭东，刘文俊，王德山

(辽宁中医药大学生理教研室，沈阳110847)

中医藏象理论认为，“脾藏意，在志为思”。脾与人的思维、情感、记忆、行为等有着密切的联系。脾主运化，化生营气，以营养意。《灵枢·本神》曰：“脾藏营，营舍意”。只有脾气旺盛，营血充盛，人体才能进行思维、学习、记忆、情感等行为活动。脾虚患者易出现健忘、注意力不集中、思维不敏捷及智力下降等症状，说明脾与精神活动及行为发生有关。海马组织与学习、空间记忆等行为密切相关。海马组织相关神经元细胞功能异常、凋亡的发生，可引起机体行为和运动功能的改变。同时阿片肽类多种因子可通过与海马组织神经元细胞表面丰富表达的受体结合，进而对神经元细胞的功能及活性调节，最终引起机体行为的改变。高表达β内啡肽(β-EP)可使海马组织神经元细胞功能下降、产生中枢性抑制作用的根源。蛋白激酶A(PKA)是依赖环磷酸腺苷(cAMP)的蛋白激酶，是细胞信号转导通路中的重要一员。因此，作为脾阳虚证主症的“神疲、乏力”的发生，可能与海马组织中枢性抑制作用有关，但其具体发生机制不明确。2016年9月～2017年8月，我们观察了附子理中丸灌胃的脾阳虚证模型大鼠海马组织β-EP、cAMP、PKA及神经元细胞μ受体表达变化，并分析其可能作用机制。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 动物分组 SPF级SD雄性大鼠40只，7～8周龄，体质量(220±10)g，适应性饲养1周，按体质量分层后,采用随机数字法分为4组：空白对照组(空白组)、脾阳虚模型组(模型组)、附子理中丸治疗组(中药组)、脾阳虚自然恢复组(自愈组)，每组10只。

1.2 脾阳虚证模型模型制备及附子理中丸给药方法 模型组、中药组、自愈组采用饮食失节+劳倦等复合因素方法，即饱食1日，禁食2日，每日游泳至力竭，连续2周，制备脾气虚模型，在此基础上应用“苦寒泻下”法，通过连续灌服100%番泻叶，1 mL/100 g,2次/d，连续2周，制备脾阳虚模型。在模型建立后，中药组给予附子理中丸1:1水溶液灌胃，给药量为2 mL/(100 g·d)，1次/d，给药2周。空白组不施加任何干预因素。模型评价标准[1，2]采用主症+次症法，具体如下：主症为神疲，乏力,体温下降，便溏，不欲饮；次症为食少，毛色枯槁无华；评价标准为3项主症+1项次症或2项主症+2项次症为动物模型复制成功，不符合上述评价标准实验动物予以剔除。

1.3 大鼠行为运动功能观察

1.3.1 大鼠行为学观察 采用旷场实验检测各组大鼠行为学改变，评价其中枢性疲劳，即神疲。实验时将大鼠放入箱体底面中心，实时摄像5 min，观察大鼠水平运动距离、直立次数。重复3次，取平均值。

1.3.2 大鼠前肢抓力测定 分别于第2、4周末，采用YLS-13A大小鼠抓力测定仪检测各组大鼠前肢抓力，评价躯体疲劳，即乏力，由专人操作以降低误差。实验时，抓持大鼠轻拿轻放，避免激怒，右手将大鼠抓住后按放在抓力板上，左手向前推住抓力板，然后右手向后滑至鼠尾部，左手轻轻松开抓力板，抓力板随右手拉鼠尾的力量向前滑行，等动物用力抓住抓力板时及时 加力后拉，以得到动物的最大抓力。每只大鼠连续检测3次，取平均值。

1.4 大鼠海马组织β-EP、cAMP、PKA及神经元细胞μ受体表达检测

1.4.1 大鼠海马组织β-EP、cAMP、PKA检测 分别于第2、4周，5%水合氯醛0.5 mL/100 g麻醉大鼠，断头分离脑组织，钝性剥离海马组织，左侧海马组织置于无菌低温冷冻管中，-80 ℃保存；右侧海马组织置于4%多聚甲醛溶液中固定，常温保存。采用ELISA法：取海马组织，1∶1加入4 ℃生理盐水，冰上研磨2 min，低温高速离心机10 000转/分，离心10 min，取上清液。大鼠cAMP ELISA Kit试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术开发有限公司，编号：CSB-E07298r)；大鼠β-EP ELISA Kit试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术开发有限公司，编号：CSB-E08206r)；大鼠 PKA ELISA Kit试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司，编号：D730517-0096]，所有操作均严格按照按照试剂盒说明书操作。应用 Bio-Rad美国伯乐iMark酶标仪检测海马组织β-EP、cAMP、PKA。实验重复3 次，取平均值。

1.4.2 大鼠海马组织神经元细胞 μ受体检测 采用免疫组化SABC法。4%多聚甲醛固定海马组织，常规石蜡包埋切片，PBS 冲洗3次×5 min；室温正常山羊血清封闭20 min；滴加兔抗大鼠μ抗体(北京博奥森生物技术有限公司，编号：bs-1195R)，4 ℃过夜，PBS 冲洗3次×5 min；滴加生物素标记羊抗兔IgM抗体，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3次×5 min；加入SABC 试剂，37 ℃孵育30 min，DAB 显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。阴性对照采用抗体稀释液代替一抗，步骤同上。利用 BI-2000系统，在光镜下(10×20倍)选取相同部位相同视野照相分析，计算每个视野阳性染色的平均光密度OD值。阳性表达神经元细胞表现为细胞膜呈现褐色或深棕色颗粒附着，平均光密度增强。重复3 次，取平均值。

2 结果

2.1 大鼠水平运动距离、直立次数比较 各组大鼠水平运动距离、直立次数比较见表1 。

2.2 大鼠前肢抓力比较 中药组、自愈组、模型组、空白组大鼠前肢抓力分别为(1 686.27±180.20)、(1 582.33±180.74)、(1 225.61±122.90)、(1 551.53±158.68)g，与空白组比较，模型组大鼠前肢抓力下降(P<0.01)；与模型组比较，中药组和自愈组大鼠前肢抓力增强(P均<0.01)。

表1 各组大鼠水平运动距离、直立次数比较

注：与空白组比较，*P<0.01；与模型组比较，▲P<0.01；与中药组比较，#P<0.01。

2.3 大鼠海马组织β-EP、cAMP、PKA含量比较 各组大鼠海马组织β-EP、cAMP、PKA含量比较见表2。

表2 各组大鼠海马组织β-EP、cAMP、PKA含量比较

注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，▲P<0.05；与中药组比较，#P<0.05 。

2.4 大鼠海马组织神经元细胞μ受体光密度比较 中药组、自愈组、模型组、空白组大鼠μ受体光密度分别为62.96±10.20、78.18±6.14、83.78±7.44、58.38±8.02。与空白组比较，模型组、自愈组大鼠海马组织μ受体光密度升高(P均<0.05)；与模型组比较，中药组大鼠海马组织中神经元细胞μ受体光密度降低(P<0.05)；与自愈组比较，中药组大鼠海马组织中神经元细胞μ受体光密度降低(P<0.05)。

3 讨论

中医学认为脾阳虚证多由脾气虚证基础上，寒邪伤及脾阳所致，其表现为在脾气虚所致食少纳呆、腹胀腹泻、神疲乏力等症状基础上，出现形寒肢冷、四肢不温、大便稀溏、腹痛绵绵等临床症状。中医藏象理论认为，“脾在体合肉，主四肢”。脾之与肉，在生理上，脾运化水谷，化生气血，以充养肌肉，肌肉健壮而有力。《素问·阴阳应象大论》曰：“脾生肉”，《素问·平人气象论》亦曰：“脾藏肌肉之气”等，都说明了肌肉赖以脾化生的气血充养。若脾失健运，气血乏源，濡养不足以致肌肉痿软，四肢倦怠无力。故有《难经·十六难》关于“怠堕嗜卧，四肢不收，有是者，脾也”的论述。“脾藏意，在志为思”。脾与人的思维、情感、记忆、行为等有着密切的联系。脾主运化，化生营气，以营养意。《灵枢·本神》曰：“脾藏营，营舍意”。只有脾气旺盛，营血充盛，人体才能进行思维、学习、记忆、情感等行为活动。临床上脾虚患者易出现健忘、注意力不集中、思维不敏捷及智力下降的表现，就体现了脾与精神活动和行为发生的密切关系。附子理中丸(汤)是中医“温中健脾”法治疗脾阳虚证的经典方剂，由张仲景所著《伤寒论》中“理中汤(丸)”(人参、干姜、炙甘草、白术)加附子而成。该方温中祛寒，补气健脾，治脾胃虚寒证，自利不渴，呕吐腹痛，腹满不食及中寒霍乱，阳虚失血，胸痞虚证，胸痛彻背，倦怠少气，四肢不温。

cAMP-PKA信号通路是经典的G蛋白耦联受体信号转导通路，可将细胞外激素、神经肽类物质的生物分子信号传递至细胞内，引发生相应的物学效应。首先激素及神经肽类物质与受体结合，活化G蛋白偶联受体(Gi或Gs)将信号首先传至腺苷酸环化酶(AC)，由它控制cAMP的含量，cAMP决定蛋白激酶A(PKA)的活性，PKA负责很多蛋白的磷酸化，比如受体，离子通道，转录因子等等，由此调节细胞内的生物活性反应和平衡。

β-EP是重要的脑肠肽之一，主要依赖于与分布在中枢及外周组织中的阿片受体结合发挥生物学作用。目前研究[3]发现其主要受体有μ、κ、δ等，其生物学功能参与体内神经、精神、内分泌、消化、呼吸、心血管、睡眠、觉醒以及学习、记忆的调节,保持各项功能活动的平衡。β-EP在局部组织中大量蓄积可通过与受体结合抑制cAMP-PKA信号通路的活性，进而引发细胞功能的抑制。同时PKA活性的降低可引起细胞内相应底物的磷酸化活性而引发生物学效应。禁食和过度运动能够诱发β-EP的过度释放[4～7]。同时，“饮食失节”和“疲劳”是脾虚证的重要致病因素。吕琳等[8]研究发现，脾虚大鼠胃、肠组织中的β-EP含量明显高于同期对照组，而垂体、下丘脑和血浆中的β-EP含量明显低于同期对照组，认为β-EP的紊乱是脾虚证微观病变特征之一。谭静等[9]研究发现，脾虚大鼠血浆β-EP和胃动素(MTL)含量较对照组大鼠显著降低，而生长抑素(SS)含量则升高，提示脾虚症可能与β-EP分泌和代谢功能紊乱有关。脾虚证中β-EP及其受体在血清、海马、下丘脑、胃肠道表达异常，提示“脾失健运”状态下，β-EP对神经-内分泌-免疫网络调控作用异常，但其细胞信号转导的机制尚不明确[10，11]。

本实验研究结果表明，模型组大鼠海马组织β-EP及其受体高表达，这一细胞外信号的激活，通过G蛋白耦联受体传导至细胞内，引起细胞cAMP含量降低，导致PKA合成减少，磷酸化活性下降。β-EP能够直接激活细胞膜K+通道，引起K+外流，使神经元细胞超极化，降低神经元兴奋性，同时抑制细胞内cAMP的合成，降低其生物活性，进一步抑制神经元细胞的活性[12]。亦可以影响Na+-K+-ATP酶活性，使Ca2+大量内流，使细胞膜稳态破坏和超微结构损伤，引发细胞凋亡[13]。由此我们推测海马组织中β-EP含量和受体的高表达，引发了细胞内cAMP-PKA信号转导通路活性下调，导致神经元功能的抑制，进而引起模型组大鼠出现中枢性神疲乏力、食少纳呆的宏观表征改变。同时，附子理中丸能够降低因造模因素施加所导致中枢神经系统的β-EP过度释放和μ受体高表达变化，改善cAMP-PKA信号通路的活性变化，逆转β-EP对中枢神经系统的抑制作用。

综上所述， 附子理中丸可改善脾阳虚证模型大鼠的脾阳虚证“神疲、乏力”等生物学行为，其机制可能为促进海马组织β-EP含量降低、cAMP及PKA含量升高、神经元细胞μ受体表达增加。