瘢痕组织中胶原蛋白提取及纯化研究

朱伟东 王富生 王志远

摘 要：目的 优化实验条件，建立提取瘢痕胶原蛋白的可靠方法。方法 选择2015年1月～2016年12月本院20例手术整形切除增生性瘢痕的标本进行研究，用胃蛋白酶的消化方式、用盐酸溶解法提取瘢痕胶原，用氯化钠盐析法制成胶原蛋白膜，用吸收光谱分析、氨基酸成分分析对胶原蛋白进行鉴定。结果 20例胶原标本提取胶原蛋白，通过氨基酸成分分析甘氨酸占30%以上，吸收光谱分析在230 nm处有吸收波峰，证实提取物为来自皮肤瘢痕组织Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白。结论 用酶消化、酸溶解、盐析法提取瘢痕胶原蛋白，方法可靠，操作简单，提取胶原蛋白纯度高，符合Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白特征，制成胶原蛋白膜为进一步研究瘢痕提供了生物学模型。

关键词：增生性瘢痕；胶原蛋白；胶原提取；胶原膜

中图分类号：R622 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.17.025

文章编号：1006-1959（2018）17-0084-03

Abstract：Objective To optimize experimental conditions and establish a reliable method for extracting scar collagen.Methods From January 2015 to December 2016，20 specimens of surgically resected hypertrophic scars were selected from the hospital.Pepsin digestion method was used to extract scar collagen by hydrochloric acid dissolution method，and collagen was prepared by sodium chloride salting out method.The protein film was identified by absorption spectroscopy and amino acid composition analysis.Results Collagen was extracted from 20 collagen samples， and glycine accounted for more than 30% by amino acid composition.Absorption peaks were observed at 230 nm by absorption spectrum analysis，and the extracts were confirmed to be collagen I and III from skin scar tissue.Conclusion The scar collagen was extracted by enzyme digestion，acid dissolution and salting out.The method was reliable，simple，and the purity of collagen extraction was high，which was consistent with the characteristics of type Ⅰ and Ⅲ collagen.The preparation of collagen membrane provides a biological model for the further study of scar.

Key words：Hypertrophic scar；Collagen；Collagen extraction；Collagen membrane

增生性瘢痕和瘢痕疙瘩是皮肤创伤修复过程中胶原过度增生所致，这个过程并不随创面修复而停止，其发生受全身及局部多种因素影响，从瘢痕组织中提取胶原蛋白，进行相关生物化学研究和分子学研究是进行有关瘢痕发生、发展及转归的生物学模型，本课题旨在探索从瘢痕组织中提取纯的胶原蛋白，为后期进一步研究提供生物学模型。我院开展在实验室条件下提取增生性瘢痕中提取胶原蛋白，并同时探索胶原蛋白成膜技术，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般資料 选取2015年1月～2016年12月深圳市龙岗区第二人民医院烧伤整形外科增生性瘢痕组织来自于门诊和住院患者20例，所取瘢痕组织为手术整形切除组织，标本取材前向患者说明目的并征得同意。男性 14例，女性6例，年龄8～38岁，平均年龄（22.45±5.65）岁，病程6个月～20年，平均病程（2.47±7.85）年；瘢痕组织来自烧伤瘢痕15例，外伤瘢痕3例，感染瘢痕2例；取材部位：面部 5例，颈部2例，耳2例，前胸3例，会阴1例，四肢7例。

1.2方法 标本处理：切去瘢痕组织放置在无菌袋中，4 ℃冰箱保存，术后修剪切除瘢痕组织，剪除残留表皮组织，毛囊等皮肤附属组织，切除皮下脂肪组织备用。用电子天平称40 g瘢痕组织，用剪刀修成0.1 mm×0.1 mm 微粒组织，放入搅拌机加入蒸馏水100 ml搅拌粉碎5 min，离心机离心4 min，弃去上清液，沉淀物放八锥形烧瓶内，加入用10倍体积的40 ml/L盐酸（pH7.5，0.05 mol/L Tris-HC1配制）混悬后，放置在4 ℃冰箱中24 h，定期摇晃，用盐酸除去胶原杂质。离心机离心：4000 s速离心10 min，分离得到上清液（S1）和沉淀。沉淀用Tris·HCI缓冲液和0.5 mol/L乙酸充分洗涤后，24 h后弃上清液，沉淀用Tris·HCI缓冲液和0.5 mol/L乙酸充分洗涤后，用5倍体积的胃蛋白酶消化液（0.5 mol/L乙酸配成1 g/L）混悬，分成2份。其中1份离心机4000 r/min

速下离心10 min，收集上清液，沉淀加4倍体积的胃蛋白酶消化液重复酶解1次，离心，取上清液，再搅拌5 min，离心得到上清液为液态粗制胶原。在粗制胶原中加入氯化钠使其浓度为1 mol/L，4 ℃盐析过夜，离心后弃去上清液，沉淀物中加入0.5 M乙酸，即为精制胶原，将精制液态胶原放入圆盘器皿中，表面加入固体氯化钠（比例0.1 g/ml），器皿液态胶原中水分析出，底层沉淀物为形成胶原膜，胶原膜干燥后即瘢痕胶原蛋白膜。

2结果

采用上述酶消化法及酸溶解法，我们共提取瘢痕胶原20批液态精制胶原，将所得精制胶原标本做氨基酸含量分析及紫外分光吸收检验，结果如下。

2.1氨基酸含量分析结果 甘氨酸占氨基酸总量的30%以上，符合来源瘢痕皮肤组织胶原蛋白的标准，见表1。

2.2紫外分光吸收检验结果 标本中的胶原蛋白在230 nm波长下有强烈的光吸收.符合来源皮肤胶原蛋白的特性，见表2。

2.3胶原浓度的测定 应用微量凯氏（ Kjedahl）法定氮法对20批胶原进行胶原浓度的测定，结果为（5.42±1.25）%。

2.4盐析成膜法 所成的膜测定pH 3～4呈酸性，故我们称之为酸性膜。用Tris/HC1漂洗后浸泡过液，pH为4～5该膜呈半透明状，同样可用平镊提起。

2.5胶原蛋白模型制备 胶原蛋白成膜后，干燥脱水后即为胶原蛋白模型。

3讨论

创面修复过程中，成纤维细胞过度增生，胶原蛋白合成酶活性增强，胶原蛋白合成增多，结果产生大量胶原沉积，是局部瘢痕增生的基础，尤其是在深度烧伤创面愈合中，胶原蛋白合成和沉积并不随创面的愈合而停止，最终结果，深度创面基本愈合时，创面平整，随后局部瘢痕仍然不停增生，瘢痕增生受许多因素影响，许多研究表面，瘢痕增生过程中，胶原合成速度大于胶原降解，胶原合成酶的活性增强[1]。本课题研究从瘢痕中提取胶原蛋白，并在实验条件下制成胶原膜，为瘢痕发生进一步研究，如胶原蛋白合成酶活性，胶原蛋白降解提供了分子生物学模型。从国内外文献报道中，用酶消化、酸溶解、盐析法等方法从胎盘，皮肤，软骨提取纯化胶原蛋白报道[2] ，深圳市医学信息中心提供文献检索报告中，未见全面针对从增生性瘢痕或瘢痕疙瘩的胶原实验室提取和成膜技术研究的文献报道。人真皮组织中胶原提取方法有蛋白酶消化法、酸溶解法 、盐析法提取胶原组织[3]。本课题借鉴上述方法也采用胃蛋白酶消化法、酸溶解法及盐析法从瘢痕中提取胶原蛋白并制成胶原膜，在胶原蛋白鉴定实验时，从胶原蛋白中氨基酸含量成分分析，甘氨酸占30%，胶原蛋白光譜分析，波峰230 nm处有吸收高峰，及蛋白电泳结果证实，提取胶原蛋白符合Ⅰ、Ⅲ型胶原特征，因Ⅰ、Ⅲ型胶原来源于皮肤真皮组织，符合本课题皮肤瘢痕取材来源，Ⅱ型胶原来源于软骨组织，生物学特征与上述二者不同[4]胶原的提取方法。主要有酶消化和酸溶解法。酸溶解法可将没有交联的胶原分子溶解提取出来，也可溶解含有醛胺类交联键的胶原纤维，因为这类交联键在酸性条件下不稳定。但当用酸溶解法提取成年动物组织中的胶原时，只能提取出Ⅰ型胶原原。酶消化法则可将胶原分子中两端非杆状三螺旋结构里的肽链水解， 末端肽亦被切割下来。所以胃蛋白酶消化法提取胶原，酶可消化表皮细胞，和血管内皮细胞，消化细胞和细胞间质，搅拌和离心后除去胶原以外杂质。酸溶解法可使胶原蛋白分解为多肽大分子物质，离心后纯化，使胶原从粗制变为精制。

胶原成膜，盐析法可使胶原蛋白脱水，纯化胶原蛋白，并制成膜，盐析法可使胶原从提取后液态变为固态状，固态胶原膜干燥后可长时间，常温下保存，为进一步研究瘢痕提供了一个好的瘢痕生物学模型，为后期进行相关瘢痕研究打下良好基础。

参考文献：

[1]蔡明达，胡大海，刘佳琦，等.增生性瘢痕防治的研究进展[J].中国医药导报，2015，12（35）：31-34.

[2]唐云平，郑强，胡斌，等.重组胶原蛋白制备及其应用研究进展[J].食品工业科技，2016，37（18）：384-386.

[3]周爱梅，张静，邓爱鹏，等.重组人源胶原蛋白的分离纯化及其结构表征[J].食品与发酵工业，2015，41（3）：46-52.

[4]刘志勤，刘浩，冯成宝，等.从牛软骨中提取Ⅱ型胶原蛋白及初步构建软骨支架[J].黑龙江大学自然科学学报，2016（3）：386-391.

收稿日期：2018-7-9；修回日期：2018-7-19

编辑/雷华