醋酸菌麸曲制备工艺的优化

潘婉舒彭 杨杜大钊吴远明刘 芳王 瑞敖晓琳,3刘书亮,3

PAN Wan-shu1 PENG Yang1 DU Da-zhao2 WU Yuan-ming2 LIU Fang1 WANG Rui1 AO Xiao-lin1,3 LIU Shu-liang1,3

(1. 四川农业大学食品学院，四川 雅安 625014；2. 四川保宁醋有限公司，四川 阆中 637400；3. 四川农业大学食品加工与安全研究所，四川 雅安 625014)

(1. College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an, Sichuan 625014, China; 2. Sichuan Baoning Vinegar Co., Ltd., Langzhong, Sichuan 637400, China; 3. Research Institute of Food Processing and Security, Sichuan Agricultural University, Ya’an, Sichuan 625014, China)

四川麸醋以麸皮为主要原料，通过传统固态发酵工艺精酿而成[1]，尤以保宁醋最为有名，为中国传统的四大名醋之一。麸醋发酵醅内含较多疏松料，可容纳一定的空气和水，固、液、气三相共存，适合多种微生物生长繁殖。麸曲常用人工培养曲霉菌制得，作为食醋发酵过程中的糖化剂[2]。食醋酿造过程中曲的种类与质量影响食醋生产周期、成品醋的品质及出醋率的高低。四川麸醋现在大多是生料固态开放性多种微生物共同发酵，醋酸菌作为发酵的主要微生物之一，主要来源于回糟、生产原料及环境，其丰度较低使醋酸发酵相对较弱，导致食醋的产率较低[3-6]；同时，食醋中乙酸含量在有机酸组分中相对较低，保宁醋中乙酸的含量仅占总酸含量的27.09%[7]，可能一定程度影响了主体风味形成。因此，为了利于生产实施，非常有必要在四川麸醋传统固态发酵中强化优良醋酸菌，而食醋发酵过程中麸曲的制备和醋酸菌的应用也被越来越多学者关注。

实际生产中，受到生产成本、原料选择、酿造工艺等因素限制，菌种种子液的生物量难以达到最适的接种浓度。郭明烨等[8]通过对醋酸菌培养条件、米酒培养基酒精质量分数、接种量进行优化，醋酸菌种子液的最大生物量仅达到107CFU/mL，种子液的生物量较低。同时，醋醅中含水量多，会导致实际生产中食醋成熟期延长，对企业的经济效益产生影响。李玉斌等[9]以四川保宁醋为研究对象，在其发酵过程中添加醋酸菌二级种子液作为生物强化剂，但是液体种子液的添加影响食醋风味物质产生和食醋成熟期的延长。因此，这些研究所采用的方法仍未达到较佳的工业利用价值。

为进一步提高醋酸菌种子的生物量、严格把控食醋品质、控制食醋发酵周期，本研究以前期筛选出的优良巴氏醋杆菌(Acetobacterpasteurianum)C9-4[10]作为固态醋醅发酵的生物强化菌株，拟采用响应面法对醋酸菌制备成麸曲种子进行工艺优化，为解决上述问题和进一步在四川麸醋固态发酵中实现醋酸菌麸曲强化接种提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

巴氏醋杆菌(Acetobacterpasteurianus)C9-4：从四川保宁醋醋醅中分离，保存于本实验室；

麸皮：市售；

醋酸菌液体培养基：酵母膏1 g/100 mL，葡萄糖1 g/100 mL，121 ℃灭菌20 min，使用前加入3 mL/100 mL无水乙醇；

醋酸菌平板及斜面保藏培养基：醋酸菌液体培养基添加琼脂粉1.8 g/100 mL，CaCO31.5 g/100 mL；

麸皮培养基：准确称取麸皮10 g于250 mL三角瓶中，按麸皮质量的90 mL/100 g加入蒸馏水，拌和均匀，蒸料灭菌(121 ℃)20 min，灭菌后趁热摇动三角瓶使料块分散、冷却备用。

1.2 仪器与设备

精密电子天平：TE412-L型，北京赛多利斯仪器系统有限公司；

立式自动电热压力蒸汽灭菌锅：LDZX-40AI型，上海三电医疗核子仪器厂；

电热恒温培养箱：DHG-9162型，上海一恒科技有限公司；

电热恒温水浴锅：HWS24型，上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化及种子液的制备 取菌株C9-4划线于醋酸菌斜面，30 ℃培养24 h，活化2次。取菌株斜面物用5 mL无菌生理盐水洗下菌体并调整醋酸菌浓度至108CFU/mL，制成一级醋酸菌种子。

将一级醋酸菌种子液按5 mL/100 g接种至麸皮培养基中，30 ℃、180 r/min振荡培养24 h，制成二级醋酸菌种子。

1.3.2 三角瓶曲的制作及生长曲线测定 在三角瓶麸皮培养基中加入乙醇3 mL/100 g，乙酸2 mL/100 g，接种5 mL/100 g 的二级醋酸菌种子。置于30 ℃条件下培养，每6 h取样一次测定醋酸菌菌落总数，72 h后完成生长曲线测定，确定三角瓶曲的最适培养时间。

1.3.3 单因素试验设计 参照1.3.2制曲方法，根据文献[9]固定麸皮10 g，选择乙酸含量、乙醇含量、水分、醋酸菌接种量、氧含量作为影响麸曲醋酸菌菌落总数的主要因素，通过单因素试验结果选取响应面的因素和水平。

(1) 水分对麸曲醋酸菌菌落总数的影响：乙醇3 mL/100 g，乙酸2 mL/100 g，接种量5 mL/100 g，胶塞，麸皮培养基中水分含量分别设为110 g/100 g·麸皮，100 g/100 g·麸皮，90 g/100 g·麸皮，80 g/100 g·麸皮，70 g/100 g·麸皮，30 ℃ 发酵48 h结束后取样并测定醋酸菌菌落总数。

(2) 乙酸含量对麸曲醋酸菌菌落总数的影响：水分按麸皮质量的90 g/100 g·麸皮，乙醇3 mL/100 g，接种量5 mL/100 g，胶塞，麸皮培养基中乙酸含量分别设为0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 mL/100 g，30 ℃发酵48 h结束后取样并测定醋酸菌菌落总数。

(3) 乙醇含量对麸曲醋酸菌菌落总数的影响：水分按麸皮质量的90 g/100 g·麸皮，乙酸2 mL/100 g，接种量5 mL/100 g，胶塞，麸皮培养基中乙醇添加量分别设为1，2，3，4，5 mL/100 g，30 ℃发酵48 h结束后取样并测定醋酸菌菌落总数。

(4) 接种量对麸曲醋酸菌菌落总数的影响：水分按麸皮质量的90 g/100 g·麸皮，乙醇3 mL/100 g，乙酸2 mL/100 g，胶塞，麸皮培养基中醋酸菌接种量分别设为2，4，6，8，10 mL/100 g，30 ℃发酵48 h结束后取样并测定醋酸菌菌落总数。

(5) 氧含量对麸曲醋酸菌菌落总数的影响：水分按麸皮质量的90 g/100 g·麸皮，乙醇3 mL/100 g，乙酸2 mL/100 g，接种量5 mL/100 g，麸皮培养基分别用4层纱布、棉塞、硅胶塞控制氧含量，30 ℃发酵48 h结束后取样并测定醋酸菌菌落总数。

通过SPSS 22显著性分析确定显著影响因素。

1.3.4 响应面Box-Behnken设计 根据单因素试验结果，选择显著影响的3个因素，用Design-Expert 8.0软件进行Box-Behnken中心组合设计，以醋酸菌菌落总数为响应值，建立预测模型并进行验证实验，最终确定三角瓶曲最优制备条件。

1.3.5 麸曲制备工艺的应用 应用上述优化的工艺参数，在某食醋生产企业进行麸曲的生产，通过三角瓶、曲盘、种子罐、曲床对醋酸菌进行逐级扩培制备麸曲。

(1) 三角瓶及曲盘的醋酸菌麸曲制备同文中确定的三角瓶麸曲制备工艺。

(2) 醋酸菌种子罐培养条件：采用霉菌种曲机进行制备。60 kg粗麸皮、水分按麸皮质量的90 g/100 g·麸皮、接种量5 mL/100 g，30 ℃下持续通风补湿培养48 h。

(3) 醋酸菌厚层通风制曲条件：采用厚层通风曲床制备。800 kg粗麸皮、水分按麸皮质量的100 g/100 g·麸皮、接种量3 mL/100 g，风机作用湿度32 ℃，持续补湿培养48 h。在麸曲扩培过程中取样测定醋酸菌的菌落总数。

1.4 醋酸菌菌落计数

将样品进行10倍梯度稀释，选取适宜稀释度2～3个，每个稀释液吸取1 mL加入平皿中，每个稀释液重复2个平皿，倾注法添加醋酸菌固体培养基，混匀、凝固、倒置于培养箱中，30 ℃培养48 h后计数。

2 结果与分析

2.1 醋酸菌在三角瓶麸皮培养基的生长曲线

将巴氏醋杆菌C9-4接种至三角瓶麸皮培养基中，测定生长曲线如图1所示。由图1可知，前24 h内醋酸菌处于迟缓期，24～48 h为对数生长期，48 h后进入稳定期，确定醋酸菌的培养时间为48 h。

图1 巴氏醋杆菌C9-4在麸皮培养基中的生长曲线

2.2 单因素试验

2.2.1 乙酸添加量对醋酸菌生长的影响 三角瓶麸曲培养基中醋酸菌初始浓度为1.15×106CFU/g。由图2可知，经过单因素方差分析后显示不同浓度底酸添加量差异显著(P<0.05)，随着底酸浓度的增加，醋酸菌数量先增加后减少，底酸添加量<2 mL/100 g时醋酸菌数量级>107，而添加量为4 mL/100 g时数量级仅为105，说明低浓度的底酸有利于醋酸菌的生长繁殖，而较高浓度的底酸能明显抑制醋酸菌的生长甚至导致部分醋酸菌细胞死亡，与文献[11]所得结果一致。因此，底酸添加量控制在1 mL/100 g左右为宜。

不同字母表示差异显著(P<0.05)

2.2.2 乙醇添加量对醋酸菌生长的影响 三角瓶麸曲培养基中醋酸菌初始浓度为1.64×106CFU/g。由图3可知，经过单因素方差分析后2 mL/100 g梯度与其他组醋酸菌总数差异显著，但多重比较时仅5 mL/100 g 梯度与其他组差异极显著(P<0.01)，1～4 mL/100 g的乙醇添加量对醋酸菌生长影响不大，都能达到107数量级，其中2 mL/100 g乙醇添加量可使醋酸菌数量达到较大值，可能是在底酸的作用下，醋酸菌可利用适量乙醇产酸后受到一定抑制。因此，乙醇添加量控制在2 mL/100 g左右为宜。

不同字母表示差异显著(P<0.05)

2.2.3 水分添加量对醋酸菌生长的影响 三角瓶麸曲培养基中醋酸菌初始浓度为1.16×106CFU/g。由图4可知，经过单因素方差分析后90 g/100 g·麸皮梯度与其他组差异显著，醋酸菌在水分含量>80 g/100 g·麸皮时生长较为旺盛，数量级均可以达到107，在水分添加量为90 g/100 g·麸皮时达到最大值，因此选用此条件为后续优化条件。因此，水分添加量控制在90 g/100 g·麸皮为宜。

不同字母表示差异显著(P<0.05)

2.2.4 接种量对醋酸菌生长的影响 三角瓶麸曲培养基中醋酸菌初始浓度为1.66×106CFU/g。由图5可知，随着接种量的增加醋酸菌生长呈现先增长后降低的趋势，经过单因素方差分析4 mL/100 g梯度与其他组差异显著，但5组数据生长均达到107，多重比较时4 mL/100 g与6 mL/100 g 2个梯度与其他组差异极显著(P<0.01)，因此响应面选取2，4，6 mL/100 g 3个梯度。

2.2.5 氧含量对醋酸菌生长的影响 三角瓶麸曲培养基中醋酸菌初始浓度为1.18×106CFU/g。醋酸菌属于好氧菌，但是由于培养时间只有48 h，三角瓶中有足够的氧气供醋酸菌生长繁殖，因此三角瓶不同的封口方式对其生长繁殖产生影响不明显，见图6。因此，三角瓶应选取3种塞子均可。

不同字母表示差异显著(P<0.05)

Figure 5 The influence of the amount of inoculation on the growth ofA.pasteurianumC9-4 (n=3)

不同字母表示差异显著(P<0.05)

Figure 6 The influence of the amount of oxygen component on the growth ofA.pasteurianumC9-4 (n=3)

2.3 回归模型的建立与检验

2.3.1 因素与水平的选择 根据单因素试验结果，选择变量中对醋酸菌菌落总数影响显著的乙酸、乙醇、接种量作为影响因子，以醋酸菌菌落总数为响应值，设计三因素三水平的响应面试验，因素编码及水平见表1。

2.3.2 回归模型的建立与检验 响应面设计方案及结果见表2，每个试验做3组平行，取其平均值。采用Design. Expert 8.0软件对表2中的数据进行多元回归拟合，分析结果见表3，得到醋酸菌菌落总数对乙酸、乙醇、接种量的二元多项式回归模型为：

(1)

表1 响应面因素水平表

图7、8分别为多因素之间的交互作用对醋酸菌菌落总数影响的响应面图与等高线图。当响应面分析图为山谷曲面，并且特征值均为正值，该响应面有极小值存在；当响应面分析图为山丘曲面，并且特征值为负值，该响应面有极大值存在；当响应面分析图为马鞍曲面，并且特征值有正有负，无极值存在[12-15]。

表2 Box-Behnken试验设计结果

表3 回归模型方差分析†

† **：P<0.01；*：P<0.05；R2=98.05%；校正R2=94.55%。

图7 交互作用对醋酸菌菌落总数影响的响应面图

Figure 7 The influence of ethanol, acetic acid and inoculation dose concentration on the number of acetic acid bacter of response surface

2.3.3 醋酸菌麸曲制备工艺条件的确定及验证 根据Box-Behnken试验所得的结果和二次多项回归方程，利用Design-Expert 8.0软件获得了醋酸菌麸曲制备最佳工艺条件为：乙酸添加量1.03 mL/100 g、乙醇添加量2.09 mL/100 g、醋酸菌接种量4.09 mL/100 g，此条件下醋酸菌菌落总数的预测值为1.62×108CFU/g(lg值8.21)。在以上优化条件进行验证实验，以2.59×107CFU/g醋酸菌菌落总数为初始接种量，所得醋酸菌总数可达1.38×108CFU/g(lg值8.14)，与预测值较为接近。

图8 交互作用对醋酸菌菌落总数影响的等高线图

Figure 8 The influence of ethanol, acetic acid and inoculation dose concentration on the number of acetic acid bacter of contourplots

2.4 醋酸菌麸曲逐级扩培结果

采用响应面优化的结果对醋酸菌麸曲进行逐级扩大培养，通过三角瓶、曲盘、种子罐、曲床培养出的麸曲，醋酸菌总数分别为1.83×108，1.66×108，2.60×108，6.35×108CFU/g。醋酸菌在扩培过程中菌落总数均能达到108CFU/g，证明本试验优化的醋酸菌麸曲制备条件可用于实际生产，所得醋酸菌麸曲比液态醋酸菌种子含水量低，醋酸菌数高，可望解决液态发酵剂会增大醋醅含水量和延长醋醅成熟期的问题。

3 结论

(1) 本试验将巴氏醋杆菌(Acetobacterpasteurianum)C9-4作为麸曲发酵菌株，在单因素试验基础上，运用Box-Behnken响应面设计，建立了醋酸菌麸曲制备工艺参数的二次多项式数学模型，并得出醋酸菌麸曲制备的最佳工艺条件为乙酸添加量1.03 mL/100 g、乙醇添加量2.09 mL/100 g、醋酸菌接种量4.09 mL/100 g，麸曲醋酸菌菌含量达到108CFU/g 以上，满足醋酸菌接种要求。

(2) 将优化的醋酸菌麸曲的最佳制备条件应用于实际生产中，通过三角瓶、曲盘、种子罐及曲床逐级扩大培养制备麸曲，扩培过程中醋酸菌总数均能达到108CFU/g，满足实际应用醋酸菌菌种数量级要求。研究结果对醋酸菌麸曲制备及强化醋酸菌接种发酵、提高四川麸醋的出醋率、增加乙酸含量和改良麸醋主体风味物质具有参考价值。由于大生产试验过程中生产环境不可控因素较多，在后续的研究中，还应该加强试验环境条件等方面的控制。