CFTR特异性抑制剂CFTRinh-172的高通量筛选与研究进展
2018-12-12栾剑
栾 剑
LUAN Jian
(吉林师范大学生命科学学院,吉林 四平 136000)
(College of Life Science, Jilin Normal University, Siping, Jilin 136000, China)
囊性纤维化跨膜转运调节因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)是一种定位于上皮细胞顶膜的氯离子通道,在囊性纤维化、多囊肾病、分泌性腹泻等疾病的发病机制中,扮演重要的角色。遗传性致死疾病囊性纤维化,是由于CFTR基因的突变造成,简单一个基因位点的缺失就造成整个机体所有CFTR氯离子通道功能的不足,影响着呼吸系统、消化系统、运动系统、循环系统和生殖系统的正常运作,病人平均寿命只有30余年。而当CFTR氯离子通道功能被过度激活时,会造成多囊肾病、白血病和霍乱等严重的疾病症状。因此,自1989年CFTR基因被鉴别出来之后[1],在学界造成巨大轰动,多个团队接连报道了多项高水平的研究,对CFTR的认识到达了前所未有的高度[2-5]。而能够有效调节CFTR氯离子通道活性的调节剂(包括激活剂和抑制剂两大类)也进入科研视野,迅速成为了科学研究和药物研发的热点。
自从CFTR调节剂的重要性被认知以来,相对于高亲和力高特异性的CFTR激活剂的大量涌现,抑制剂的发现和研究就显得推进缓慢,因此,每一个抑制剂的发现都显得弥足珍贵。早期的CFTR抑制剂的两大类是芳基氨基苯甲酸盐和磺酰脲类,这些物质可以进入CFTR氯离子通道的空隙当中,并通过机械性的堵塞方式,暂时性地阻止流动的一价阴离子,直到抑制剂被洗脱。芳基氨基苯甲酸中典型的有5-硝基-2-(3-苯基丙基胺)-苯甲酸(NPPB), 有报道[6]指出,该类化合物并不是CFTR氯离子通道特异性的抑制剂,膜片钳试验表明是对CFTR-电压依赖性的抑制而导致CFTR氯离子通道的闭锁。早期的磺酰脲类化合物主要是作为抑菌剂在使用,其中格列本脲在更高浓度下可以抑制CFTR[7],其作用机制是通过在CFTR氯离子通道处于开放状态时,与孔道结合并堵塞,从而达到抑制的作用[8]。虽然以上两类化合物可以抑制CFTR氯离子通道,但是,通常需要较高的浓度(>1×10-4mol)才能达到较好的效果[9],根源在于非特异性抑制剂会同时使得其下游的多种离子通道和细胞膜表面转运子都会受到影响。这些早期发现的CFTR氯离子通道的阻断物是一组结构多样的带阴离子的有机大分子,表明阻断物从胞质末端进入CFTR氯离子通道孔隙的过程几乎没有特异性或大小区分。此外,大多数阻断剂的活性较低,而且由于简单的堵塞作用机制,这些阻断剂都是没有专一性的。这些CFTR阻断剂的低活性、低专一性的性质大大限制了它们的应用前景。此外,这些物质中的部分还阻断了其他类型的氯离子通道[10],使得这类阻断剂特别容易影响到其他不同的离子通道。显而易见,专一性强的抑制剂无论在试验、造模还是药物研发方面都是极其重要的一个特性,然而,在当时并没有特异性的CFTR抑制剂被发现。
因此,对于抑制活性强、专一性高的小分子抑制剂的需求日益迫切,亟待一个全新的手段加速对潜在抑制活性的化合物进行测试和筛选。
1 CFTR小分子抑制剂的筛选策略
1.1 小分子化合物库
天然的小分子活性化合物是当今药物研发的最主要来源,随着高通量筛选技术(High Throughput Screening,HTS)的诞生和日趋完善,使得天然活性小分子的快速高效筛选成为了可能,令全球新药的开发工作有了一个质的飞跃。基于CFTR抑制剂在药物发现和药理研究中日趋迫切的诉求,许多CFTR门控调节剂研发的相关课题组都以ChemBridge公司(San Diego,USA)和ChemDiv公司(San Diego,USA)的小分子化合物库为依托,在共计超过150万小分子化合物库中筛选目的药物的先导化合物及其结构类似物,并可以依据药物性质需求对化学结构进行分析乃至定制构建全新结构的化合物。
1.2 细胞系构建
Verkman课题组[11]创造性地构建了稳定遗传的表达人源CFTR基因和H148Q基因的FRT细胞系,并以此为依托进行CFTR特异性抑制剂的高通量筛选;这种细胞系是以人的野生型CFTR基因和对卤族元素敏感的绿色荧光蛋白(H148Q)基因稳定共转染的wt-CFTR-H148Q-FRT细胞系;从报道的稳定性数据来看,构建成功的细胞系可以至少稳定传代15次而不降低YFP-H148Q荧光效能。
1.3 高通量筛选
将稳定表达野生型CFTR-YFP-H148Q的细胞系铺板培养。空白对照组加入50 μL saline;阴性对照组加入50 μL 3种混合的激活剂;阳性对照组加入50 μL 混合的激活剂加2×10-5mol CFTRinh-172;样品组在各孔中加入50 μL 混合的激活剂,于培养箱孵育5 min,再加入0.5 μL的待测化合物。通过配备有HQ500 / 20X激发和HQ535 / 30M发射滤光片(Chroma Technology)的Fluostar酶标仪(BMG LabTechnologies)记录单个孔内的荧光数据变化[图1(a)]。细胞表面的CFTR氯离子通道被混合的激活剂预先处理而活化,通道处于开放状态,卤族元素离子可以自由出入。由于细胞系表达的绿色荧光蛋白(H148Q)对卤族元素敏感,当卤族元素离子经由开放的CFTR氯离子通道进入细胞后,会使荧光猝灭。当Fluostar酶标仪向各个孔道逐一注入NaI溶液时,如果待测化合物能够抑制CFTR氯离子通道的活性,将会关闭离子通道,则I-进入胞内的量会大幅下降,而监测结果该孔的荧光信号减弱的程度明显低于对照组[图1(b)]。分析单通道荧光值的数据,可以高效筛选出具有抑制CFTR氯离子通道活性的小分子化合物。
2 噻唑烷酮小分子CFTR抑制剂
2.1 噻唑烷酮CFTR抑制剂的发现
2002年,Verkman课题组[13]依托于ChemBridge (San Diego,USA)大型的化合物库对50 000种构象各异的小分子化合物进行高通量筛选,最终得到6种2-thioxo-4-thiazolidinone化学结构的CFTR小分子抑制剂[图1(c)]。在所有直接筛选获得的化合物中以噻唑烷酮3-[(3-三氟甲基)苯基]-5-[(4-羧基苯基)亚甲基]-2-硫代-4-噻唑烷酮(CFTRinh-172)的活性最高。对CFTRinh-172的活性分析数据如下:① 在荧光细胞试验中3×10-4mol的CFTRinh-172对CFTR介导的短路电流在2 min内达到最大值;② 以与电压无关的方式抑制CFTR;③ 其抑制活性具有可逆性;④ 在细胞培养和小鼠模型中,CFTRinh-172在高浓度下没有表现出毒害性;⑤ CFTRinh-172的抑制作用具有高度的专一性,在完全抑制CFTR的浓度下,不能阻止细胞cAMP升高,不能抑制非CFTR Cl-通道或其他相关转运蛋白;⑥ 在6 min内,小鼠单次腹腔注射CFTRinh-172(250 μg/kg)可显著减少小肠中超过90%的霍乱毒素诱导的肠道液体分泌[13]。CFTRinh-172被报道之后,因其活性好专一性高引起本领域科学家的广泛兴趣,CFTRinh-172构象和活性的种种特点陆续被揭示,被誉为CFTR小分子抑制剂的金标准,目前,依然是CFTR领域科研试验的标准参照物。
A. 自动高通量筛选的原理图[12]B. 高通量筛选的流程[13]C. 上部为 2-thioxo-4-thiazolidinone CFTR抑制剂的化学构架,底部为6种有最好的CFTR抑制活性的结构类似物[13]
图1 高通量筛选CFTR氯离子通道抑制剂
Figure 1 High-throughput screening to identify CFTR inhibitors
2.2 噻唑烷酮CFTR抑制剂的构象
噻唑烷酮是一种饱和形式的噻唑烷,它的第4个碳上有羰基,被认为是一种具有几乎所有生物活性类型的神奇的核[14]。Verkman团队[15]合成了58种CFTRinh-172的结构类似物,以鉴定和改善具有较好水溶性的CFTR抑制剂。如图2所示,A环3位上的—CF3、B环上含有噻唑烷酮的核心以及 C环4号位上的羧基化合物对于CFTR的抑制作用最强。同时,还鉴定了2种具有很高抑制活性的化合物:Tetrazolo-172和Oxo-172,它们还兼具了较好的水溶性和较低的毒性,这样的结构探索使得CFTRinh-172成为相关CFTR抑制剂研究和开发的先导化合物,不断受到追捧。
2.3 噻唑烷酮CFTR抑制剂的作用机制
2002年之前发现的CFTR抑制剂都是通过简单的机械堵塞作用来阻断细胞质一侧的孔道,故而活性和专一性都较差。而CFTRinh-172分子在正常生理pH值下含有一个负电荷,并以一种与电压无关的方式阻断CFTR介导的 Cl-电流[13]。Taddei等[16]指出单通道电压膜片钳数据显示CFTRinh-172阻断CFTR氯离子通道导致通道平均闭合时间延长,而不改变通道平均开放时间。这种影响是由于平均通道关闭时间延长而没有改变平均通道开放时间。 短路电流试验[17]表明抑制野生型G551D和G1349D CFTR中Cl-电流的CFTRinh-172抑制效力相似;然而,对于ΔF508CFTR,Ki则显著降低。CFTRinh-172的应用导致平均关闭时间的延长和频道平均开放时间的缩短。数据[18]分析可见,CFTRinh-172不仅仅是简单的孔隙阻断剂:① CFTRinh-172 可以同时在CFTR氯离子通道开放和闭合2种不同的状态下与之结合;② CFTRinh-172结合引发了CFTR蛋白的变构效应,起到抑制CFTR的作用,这明显与简单的堵孔的方式不同;③ CFTRinh-172的效力与开放时间之间的关系:开放时间越长,IC50就越低;④ 不能通过干扰NBD二聚体发挥作用。
图2 噻唑烷酮CFTR抑制剂的结构活性分析 [15]
2.4 CFTRinh-172的药代动力学研究
使用14C标记的CFTRinh-172,液相色谱及质谱联用以及小鼠肠道闭环模型分析研究CFTRinh-172药理学和啮齿动物的抗腹泻效力,发现:① CFTRinh-172主要通过肾小球滤过而未经化学修饰而被清除;② CFTRinh-172在小鼠静脉输注后5 min内在肝中累积,此时胆汁中浓度是血液的5倍;③ 在给药30~240 min时,CFTRinh-172主要富集在肝、肠和肾中,在脑、心脏、骨骼肌和肺中几乎检测不到;④ 大鼠静脉推注后的药代动力学分析显示,分布容量为770 mL,再分布和消除半衰期分别为0.14,10.30 h;⑤ CFTRinh-172在肝微粒体中稳定;⑥ 小鼠肠道闭环模型研究表明,单次腹腔注射20 mg的 CFTRinh-172可抑制霍乱毒素在十二指肠和空肠中的累积,在6 h后>90%,回肠中为60%和结肠中则不足10%;⑦ 在小鼠出生后6周内,高剂量CFTRinh-172给药[3 mg/(kg·d),每日2次剂量]没有观察到毒性[19-20]。可以说,CFTRinh-172的代谢稳定性、肠肝循环、肾功能减退、肠内蓄积等特性是其良好止泻作用的主要原因。
3 噻唑烷酮CFTR抑制剂与疾病
3.1 分泌性腹泻
前面提到,CFTR氯离子通道是Cl-跨越肠道上皮细胞顶膜运输的主要途径,当CFTR氯离子通道受到肠毒素影响而功能亢进时,Cl-等电解质由小肠上皮细胞被大量排放到肠腔,从而驱动水分在渗透压作用下流失,是分泌性腹泻发病机制的关键性节点[21]。小分子CFTR抑制剂可减少动物模型中肠毒素诱导的肠道液体分泌。通过CFTRinh-172等专一性抑制剂关闭CFTR氯离子通道,在不干扰其他正常运转的离子通道和转运子的前提下,阻断电解质流失,成为治疗分泌性腹泻的新策略[22-23]。 在大鼠闭环模型中,单次腹膜内注射200 μg的CFTRinh-172阻断了90%以上的霍乱毒素和70% STa大肠杆菌毒素所诱导的肠液分泌;而在小鼠开环霍乱模型中,通过口服方法给药的CFTRinh-172降低了≥90% 的霍乱毒素诱导的肠道液体分泌量[24]。CFTRinh-172显著降低由cAMP依赖的霍乱弧菌,大肠杆菌和霍乱弧菌等病菌分泌的肠毒素引起的肠道内电解质分泌和水分流失,因此可以有效减少感染性、分泌性腹泻中的肠道液体分泌。
图3 肠道分泌途径[22]
3.2 多囊肾病
多囊肾病(PKD)是一种人类遗传性肾脏疾病,会导致肾功能衰竭。多囊肾病目前还没有获得批准的药物或是有效的预防策略,患者只能接受透析和肾脏移植。有报道[25]指出CFTRinh-172可以在MDCK细胞培养模型中抑制PKD囊肿的生长。后续有体外试验[26]表明,CFTRinh-172在肾上腺器官的培养中起到延缓囊肿生长的作用。其后有数据[27-28]显示,CFTRinh-172在试验中几乎完全抑制囊肿生长而不影响细胞增殖,同时还表现出了对囊肿数量和胚胎肾囊肿模型生长的显著抑制;对新生儿肾特异性PKD1敲除小鼠进行皮下注射,治疗小鼠7 d,对肾肿大、囊肿扩张和肾功能损害显著降低,这些结果表明CFTR抑制剂具有减少PKD中囊肿生长的潜力。需要注意的是,如果选择长期通过CFTR抑制剂治疗,意味着需要抑制超过九成的CFTR氯离子通道,而这势必会影响到呼吸系统、消化系统乃至生殖系统正常的功能。因此,CFTRinh-172投入使用尚需进一步的临床前评估来判断。
3.3 白血病
CFTR的异常表达或突变会导致一系列疾病,其中包括白血病[29]和胰腺癌[30]这样的恶性肿瘤。Yan等[31]报道CFTRinh-172可以在K562和SUP-B15细胞中降低HDAC2蛋白的表达,并导致PTEN在mRNA和蛋白质水平的增加以及PDK1和mTOR(PTEN的下游信号传导)活性的降低,而MTT试验显示CFTRinh-172可在Ph+白血病细胞中增强HDAC2的抑制剂的抗增殖作用。CFTR在急性髓系白血病患者及白血病细胞中均显著呈高表达。TF1细胞中加入CFTR特异性抑制剂后,细胞的活力下降,细胞凋亡率显著增加。CFTRinh-172可以抑制CFTR,通过经典的Wnt信号通路抑制白血病细胞株TF1的生长,并促进其凋亡[32]。
4 结论与展望
CFTR功能亢进会导致分泌性腹泻(如与霍乱相关的腹泻)肠道液体分泌过多[33]。常染色体显性遗传性多囊肾病(ADPKD)是最常见的遗传性肾病,肾上皮细胞CFTR介导的Cl-转运也是常染色体显性遗传性多囊肾病(ADPKD)肾囊肿积液和生长的基础[34]。CFTR在这种常见和严重疾病状态中的参与使其成为治疗干预的一个有吸引力的靶点,而CFTRinh-172因为直接与CFTR蛋白相互作用,高亲和性、高专一性被证明是极其有用的试验工具和先导化合物。
近年来,在CFTRinh-172发现之后,高通量筛选技术已被用于识别更有效的CFTR抑制剂,GlyH-101[35]、iOWH032[36-37]、PPQ-102[38]、Oridonin[39]等小分子化合物先后被筛选面世,获得很高评价,而天然产物中的化合物,如cocoa flavanols[40]、EGCG和ECG[41]因为其安全性也备受肯定。其中,CFTRinh-172抑制细胞膜细胞质侧的CFTR,而GlyH-101引起膜外侧的电压依赖性阻滞,它们通过不同的机制抑制CFTR。CFTRinh-172已被证明能优先与开放通道结合,可能会引发构象变化,使其失活。由于不同的侧向作用,CFTRinh-172应用于膜的胞内侧时优先,GlyH-101应用于胞外,但是这2种较强的选择性抑制剂至今依然是试验中抑制CFTR活性的首选药物。
有报道[42]指出CFTRinh-172在无CFTR氯离子通道蛋白表达的细胞中会诱导活性氧的产生,并导致线粒体功能的衰竭。由于存在潜在风险,对于CFTRinh-172的实际应用需要审慎看待,但这些试验数据与氯化物的运输损失是否有关还有待于进一步研究。而且,一直被关注的CFTRinh-172水溶性差的问题也需要通过多方面的考量来解决。尽管如此,可以乐观地预见未来10年必将会诞生CFTR抑制剂新药来预防和治疗多囊肾病、腹泻病和白血病等恶性疾病,给CFTR相关疾病的药物研发带来光明前景。